1 基因工程的基本操作程序 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤:目的基 因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细 胞、目的基因的检测与鉴定(图1-6)。 求异思维 你能推测出由mRNA反转录形成 cDNA的过程大致分为哪些乡骤 生物材料 吗?查阅相关的书籍,看看书中 所述是否与你的想法相似。 mRNA DNA 反转录 爪制酶讨啊 cDNA(互补DNA 定大小范围 DNAPCR 基因文库包括基因组文库DNA文库人工台成 第一步 获取目的基因 第二步 构建表达载体 第三步 导人受体细胞 得到转基因生物 第四步 目的基因检测与鉴定 图1-6基因工程的基本操作流程图 目的基因的获取 获取目的基因是实施基因工程的第一步。目的基因可 以从自然界中已有的物种中分离出来,也可以用人工的方 8专题1基因工程
法合成。目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因,例如, 与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生 物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因,以 及与工业所需用酶相关的基因等,也可以是一些具有调控 作用的因子。 随着科学技术的发展,获取目的基因的方法也越来越 多,目前常用的方法有以下几种。 从蒹因文中茯取目的基因 将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体 菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的 基因,称为基因文库 gene library)。基因文库就像一座图 书馆,每一个基因就是一本书。如果一座“图书馆”中包 含了一种生物所有的基因,那么,我们就可以说这个基因 文库很大,就像国家图书馆,这种基因文库叫做基因组文≯寻根问底 库( genomic library),也有一些基因文库比较小,就像某个为什么要构建基因文库?直接 市或某个单位的图书馆,只包含了一种生物的一部分基因,从合目的基因的生物体内提取 这种基因文库叫做部分基因文库,如cDNA文库(图1-7) 不行吗? 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因呢?这还是 件比较复杂的事情,简单地说就是根据目的基因的有关信 息,例如,根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在 染色体上的位置、基因的转录产物mRNA,以 及基因的表达产物蛋白质 国家图书馆 等特性来获取目的基因。 基因组文库 AHITINNN 种生物的全部基 因叫做基因组文库 Aκ 口|(部分基因文库 了!! 一种生物的 xX市图书馆 一部分基因 f 叫做部分基 因文库 图1-7基因组文库和部分基因文库 专题1基因工程9
生物技术资料卡 @@@ 基因文库的构建 将某种生物体内的DNA全部提取出来,选·生物的基因组文库。如果用某种生物发育的某 用适当的限制酶,将DNA切成一定范围大小的·个时期的mRNA反转录产生的多种互补DNA DNA片段,然后,将这些DNA片段分别与载体·(也叫CDNA)片段,与载体连接后储存在一个 连接起来,导入受体菌的群体中储存,每个受体:受体菌群中,那么,这个受体菌群体就叫做这种 菌都含有了一段不同的DNA片粳,也就是说,这:生物的cDNA文库,两种基因文库的主要区别如 个群体包含了这种生物的所有基因,叫做这种:下表所示 文库类型 DNA文库 基因组文库 文库大小 大 基因中启动子(具有启 动作用的DNA片段) 基因中内含子(位于编码蛋白 小无无 ①[质序列内的事编号DNA片段 基因多少 某种生物的部分基因 某种生物的全部基因 物种间的基因交流 可以 部分基因可以 利用PCR技术护增目的基因 多次。由于延伸后得到的产物同样可以和引 PCR是聚合酶链式反应( polymerase chain reaction)的缩写这项技术是由穆里斯: K.Ml等人于1989年发明的,为此,穆:皿wm县 t冒 n 里斯于1993年获得诺贝尔化学奖。PCR是一 模板DNA 项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合:热稳定DA 成技术。通过这一技术,可以在短时间内大:聚台酶 每一循环 拷贝数加倍 量扩增目的基因。 PCR的原理和做法并不难,它是利用 DNA双链复制的原理,将基因的核苷酸序列 加热至90-85℃ DNA解链 不断地加以复制,使其数量呈指数方式增加 HHguuIUUUT (图1-8)。利用PCR技术扩增目的基因的 前提,是要有一段已知目的基因的核苷酸序 列,以便根据这一序列合成引物。扩增的过:m 程是:目的基因DNA受热变性后解链为单:引物结合到互补DNA链 冷却55~00℃ 加热至70一75℃ 链,引物与单链相应互补序列结合,然后在 zg醇从引物起始 进行互补链的合成 DNA聚合酶作用下进行延伸,如此重复循环 图1-8PCR反应原理示意图 10专题1基因工程
物结合,因而每一次循环后目的基因的量可以增加一倍, 即成指数形式扩增(约为20,其中n为扩增循环的次数)上 述过程可以在PCR扩增仪中自动完成(图1-9)。 图1-9PCR扩增仪 此外,如果基因比较小,核苷酸序列又已知,也可以 通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。 基因表达载体的构建 基因表达载体的构建是实施基因工程的笫二步,也是 足动子 插入基因 基因工程的核心。其目的是使目的基因在受体细胞中稳定 存在,井且可以遗传给下一代,同时,使目的基因能够表 达和发挥作用。因此,一个基因表达载体的组成,除了目 表达载体 终止子 的基因外还必须有启动子( promoter)终止子 (terminater 复制原点 以及标记基因(图1-10)等。启动子是一段有特殊结构的 DNA片段,位于基因的首端,它是RNA聚合酶识别和结 抗生素抗性基因 合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得 所需要的蛋白质。终止子相当于一盏红色信号灯,使转录 图1-10基因表达载体模式图 在所需要的地方停止下来。终止子位于基因的尾端,也是 一段有特殊结构的DNA短片段标记基因的作用是为了鉴 别受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的D寻根问底 细胞筛选出来,如抗生素抗性基因就可以作为这种基因。 将生物的所有DNA直接导入受 体细胞不是更简便吗?如果这么 另外,由于受体细胞有植物、动物、微生物之分,以,结果会怎样? 及目的基因导入受体细胞的方法不同,因此,基因表达载 体的构建上也会有所差别,不可能是千篇一律的。 将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步。 专题1基因工程11
目的基因进入受体细胞内,并且在受体细胞:的细胞会分泌大量的酚类化合物,吸引农杆 内维持稳定和表达的过程,称为转化:菌移向这些细胞,这时农杆菌中的T质粒上 transformation),用什么方法将目的基因导:的T-DNA(可转移的DNA)可转移至受体细 入受体细胞呢?目前已开发出来的方法有很·胞,并且整合到受体细胞染色体的DNA上。 多种,每种方法都有其利弊,适合于不同的·根据农杆菌的这种特点,如果将目的基因插 受体细胞。究竟选用哪种方法,要根据具体:入到T质粒的TDNA上,通过农杆菌的转 情况而定。下列介绍几种常用的转化方法。:化作用,就可以使目的基因进入植物细胞, 将目的基因导入植物细胞 并将其插入到植物细胞中染色体的DNA上 将目的基因导入植物细胞采用最多的方:使目的基因的遗传特性得以稳定维持和表达 法是农杆菌转化法。农杆菌是一种在土壤中·(图1-11)。由于这种方法比较经济和有效, 生活的微生物,能在自然条件下感染双子叶·迄今为止,约80%的转基因植物都是通过这 植物和裸子植物,而对大多数单子叶植物没:种方法获得的。除此之外,还有基因枪法和 有感染能力。当植物体受到损伤时,伤口处:花粉管通道法等。 将目的基因捆入 染色体的DNA中 导入植物细駝 培养再生成植 构建表选载体 转入农杆萌 m质粒 植物细胞 FDNA 带外原含目的基因的含重组工质粒的农杆菌 重组T质粒 因的DNA 表现出新性状的植株 图1-11农杆菌转化法示意图 生物技术资料卡 基因枪法基因枪法( particle gun)又称微弹轰 空气 加速管 击法,是利用压缩气体产生的动力,将包裹在 金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞 中,使目的基因与其整合并表达的方法。常用 傲弹 的金属颗粒有钨粉粒子和金粉粒子,粒子的直 径一般在0.6-4μm,这是单子叶植物中常用的 一材料 ①一种基因转化方法,但是威本较离 基因枪法 12专題1基因工程