Sanger)发明氨基酸序列分析技术后,1977年,科学家又发 明了DNA序列分析的方法,为基因序列图的绘制提供了可 能,之后,DNA合成仪的问世又为引物、探针和小分子量 DNA基因的获得提供了方便 DNA体外重组的卖现1972年伯格(P.Berg)首先在 休外进行了DNA改造的研究,成功地构建了第一个体外重 组DNA分子 重组DNA表达卖验的成功1973年,博耶(H. Boyer) 和科恩(S. Cohen)选用仅含单一 EcoRI酶切位点的栽体质 粒pSCl01,使之与非洲爪蟾核糖体蛋白基因的DNA片段 重组。重组的DNA转入大勵杆菌DNA中,转录出相应的 mRNA。这个实验证明了质粒不仅可以作为基因工程的栽 休,重组DNA还可以进入受体细胞,外源基因可以在原核 细胞中成功表达,并实现物种之间的基因交流。至此,表 明基因工程正式问世 第一创转基因动物闷世1980年,科学家首次通过 显微注射培育出世界上第一个转基因小鼠。1983年,科学 家又釆用农杄菌转化法,培育出世界上第一例转基因烟草。 此后,基因工程进入了迅速发展阶段。 PCR技术的发明基因工程问世后,1988年 伯格 由穆里斯(K. Mullis)发明的PCR技术,使基因工 程技术得到了进一步发展和完善。 上述仅是简要提及基础理论的突破和技术的创 新。有些你已经学习过,更多的将在本专题中展开。 科学提供对自然界的说明,技术将科学原理转化为 工艺和产品,从而造福于人类。科学、技术、社会的互动, 转基因小鼠(下 与对服小鼠 不断调整着人类与自然界的关系,推动着文明的进展
DNA重组技术的基本工具 运输工具 工欲善其事,必先利其器”。我国拥有自主 知识产权的转基因抗虫棉,就是通过精心设计, 用“分子工具”构建成的。培育抗虫棉首先要在 体外对含有抗虫基因的DNA分子进行“切割 改造、修饰和“拼接”,然后,导入棉花体细胞 内,并使重组DNA在细胞中表达。实现这一精 确的操作过程至少需要三种工具.即准确切割 DNA的“手术刀”、将DNA片段再连接起来的 缝合针”、将体外重组好的DNA导入受体细胞 手术刀 的“运输工具。科学家已经找到井运用了这三 抗虫基因 种必需的工具,才使培育抗虫棉这一奇妙构想 缱合针 变成了现实(图1-1) 图1-1抗虫棉(左侧为对照 限制性核酸内切酶 分子手术刀 切割DNA的工具是限制性核酸内切酶 ( restriction endonucleases),又称限制酶( restriction enzyme)这类酶主要是从原核生物中分离纯化出来的迄 寻根问底 今已从近300种不同的微生物中分离出了约4000种限制 根据你所掌握的知识,你能推测 酶。它们能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列, 这类酶存在于原核生物中的作用 是什么吗? 并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯 键(图1-2)断开。大多数限制酶的识别序列由6个核苷 磷酸二酯键 图1-2双链DA结构和磷酸二键位置 4专题1基因工程
酸组成,例如,EoRI、Sma限制酶识别的序列均为6个 核苷酸,也有少数限制酶的识别序列由4、5或8个核苷酸 生物技术资料卡 组成。DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常 艰制酶的名字怎么起? 有两种形式——黏性末端和平末端(图1-3)。当限制酶 在它识别序列的中心轴线(图中虚线)两侧将DNA的两条 限制酶的名字是怎么起的 呢?是用生物属名的头一个 链分别切开时,产生的是黏性末端,而当限制酶在它识别 字母与种名的头两个字母 序列的中心轴线处切开时,产生的则是平末端。 @Q@ 组成了3个字母的略语,以 此来表示这个酶是从哪个生 物中分离出来的。例如 种隈制酶是从大肠杆菌 ( Escherichiacoli)的R型菌 GAA: TTC AATTC 株分离来的,就用字母BcoR ECORI 在G与A之引CTT!AAG CITAA G 表示,如果它是从大肠杆菌 R菌株中分离出来的第一个 孙性末 限制酶,则进一乡表示成 EcoRI 中轴线 CCC: GGG CCC GGG Snal (在G与C之满引)GGG!CCC GGG CCC 中轴线 平末端 图1-3切割DNA分子时产生的两种不同末端箭头表示酶的切割位置 0NA连接酶 分子缝合针 将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分 子,是靠DNA连接酶来完成的。1967年,世界 BRI切此位点 上几个实验室几乎同时发现了一种能够将两条國aAa GAATTC DNA链连接起来的酶,称之为DNA连接酶 CTTAAG CTTAAG DNA ligase)。根据酶的来源不同,可以将这些 BRI切此位点 酶分为两类:一类是从大肠杆菌中分离得到 双链断开 的,称为 E. COlI DNA连接酶另一类是从T噬 菌体中分离出来的,称为T4DNA连接酶。这两 回ATT 回 AATTC 类酶都是将双链DNA片段“缝合”起来,恢复 CTTAA回 CTTAA回 被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 不同来源的DNA片段结合 (图1-4),但这两种酶的作用有所差别:E·coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末 GAATTC CTTAAG 端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端 之间进行连接而T4DNA连接酶既可以“缝合 图1-4DNA分子的切割和连接 专题1基因工程5
寻根问底 双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA DNA连接酶与DNA聚合酶是一片段的平末端,但连接平末端之间的效率比较低。 回事吗?为什么? 基因进入受体细胞的载体—“分子运输车 用什么方法才能将外源基因送入细胞中呢?通常是利 用质粒( plasmid)作为载体( vector),将基因送入细胞中。 德一想,具备什么条件才能充 当“分子运槍车”? 质粒是一种裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外, 并具有自我复制能力的很小的双链环状DNA分子。质粒 DNA分子上有一个至多个限制酶切割位点,供外源DNA 8 DNA 片段(基因)插入其中。携带外源DNA片段的质粒进入受 体细胞后,在细胞中进行自我复制,或整合到染色体DNA 上,随染色体DNA进行同步复制。质粒DNA分子上有特 质粒 大肠杆菌细胞殊的标记基因,如四环素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因 等标记基因,供重组DNA的鉴定和选择(图1-5)。 在基因工程中使用的载体除质粒外,还有λ噬菌体的 目的基因 衍生物、动植物病毒等。它们来源不同,在大小、结构、 想入位点 氨卡青霉素 复制以及插入片段大小上也有很大差别。这些基因工程载 抗性基因 体的作用,就相当于一种运输工具,因此将它们比喻为“分 复制原点 子运输车”。 在进行基因工程操作中,真正被用作载体的质粒,都 图1-5大肠杆菌及质粒载体结构模式图是在天然质粒的基础上进行过人工改造的。 模拟制作 重组DNA分子的糢拟操作 目的要求 DNA连接酶) 模拟重组DNA分子的操作过程,说出:方法步骤 其基本原理。 1.选两种颜色的等宽硬纸板,如绿色 材料用具 :纸板和粉红色纸板。在绿硬纸板上依次等 两种颜色(如绿色和粉红色)的硬纸:距离写上下列字母(字母要清晰、工整): 板,剪刀(代表 EcoRI,透明胶条(代表 ATAGCATGCTATCCATGAATTCGGCATAC TATCGTACGATAGGTACTTAAGCCGTATG 6专题1基因工程
在粉红色硬纸板上依次等距离写上下列字母: TCCTAGAATTCTCGGTATGAATTCCATAO…… AGGATCTTAAGAGCCATACTTAAGGTATG 2.用剪刀(代表 EcoRI)进行DNA“切:黏性末端能互补配对。如果你制作的黏性 割”。先分别从两块硬纸板上的一条DNA·末端不能互补配对,说明你的操作有误, 链上找出 G-A-A-T-T-C序列,并选GA之:应重新做一次 间作切口进行“切割”,然后再从另一条链 思考与讨论 上互补的碱基之间寻找 EcorI相应的切口 请按真实操作过程思考一下 剪开 1.你模拟插入的DNA片段能称得上 3.待绿、粉红两色硬纸板上的切割位:一个基因吗? 点全部切开后,将粉红色纸板上的DNA片 2.如果你操作失误,碱基不能配对, 段,重组到绿色硬纸板的切口处。此时用·可能是什么原国造成的 不干胶(代表DNA连接酶)将切口黏结起:进一步模拟操作 来。这样你就完成了一个重组DNA分子的 如果你有兴趣,可自制有Smd切割位 模拟制作。 点的纸板,然后按上述步骤剪切和连接, 如果你的操作是正确的,不同颜色的:制成一个新的重组DNA分子。 思考与探究 1限制酶在DNA的任何部位都能将DNA切开 和—能连接形成 吗?以下是四种不同限制酶切割形成的DNA片段 和 能连接形成 (1)… CICA(2)…AC(3)GC…(4)… 和 能连接形成 CG.. ..CTTAA 2联系你已有的知识,想一想,为什 么限制酶不剪切细菌本身的DNA? (5)G…(6)…GC(7Gr…(8) AATTU… 3天然的DNA分子可以直接用做基 AaGMC. 因工程载体吗?为什么? 你能用DNA连接酶将它们连接起来吗? 4网上査询:DNA连接酶有连接单 和 能连接形成 链DNA的本领吗? 专题1基因工程7