6.什么是细胞培养，应注意哪些间题？答：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。细胞培养的突出特点是在离体条件下观察和研究细胞生命活动的规律。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、生物等外界因素的变化即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。然而，细胞在体外环境的局限性，又使细胞的形态与功能不能与体内的同类细胞完全等同。体外培养细胞必需注意三个环节：物质营养、生存环境和废物的排除。体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的。培养基通常含有细胞生长所需的氨基酸、维生素和微量元素。一般培养细胞所用的培养基是合成培养基，它含有细胞生长必需的营养成分，但是在使用合成培养基时需要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，以牛血清为主。这是因为血清中含有多种促细胞生长因子和一些生物活性物质。由于血清中含有一些不明成分，对于特殊目的细胞培养是不利的。为此，研究人员正在探索无血清培养细胞的条件，并已经取得一些进展。由于机体内的细胞生长通常需要不同的细胞因子进行调节，所以在无血清培养时仍然需要添加必要的因子，包括：促细胞生长因子(如EGF)、促贴附物(如层粘连蛋白)和其它活性物质（如转铁蛋白）。无血清培养排除了有血清培养时血清中不明因素的干扰，使实验结果更加可靠体外细胞培养必需模拟体内细胞生长的环境。环境因素主要是指：无菌环境、合适的温度、一定的渗透压和气体环境。气体主要有两种：O2和CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要。活体内生长的细胞所产生的代谢物和废物通过一定的系统进行利用和排除。体外培养细胞产生的代谢物和废物积累在培养液中，所以定期更换培养液，对于体外细胞培养也是至关重要的。7.什么是细胞系和细胞株？答：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代，或传代次数有限，可称为有限细胞系(finitecell line)，如可以连续培养，则称为连续细胞系(continuouscellline)，培养5o代以上并无限培养下去。从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cellstrain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞。从培养代数来讲，可培养到40-50代。8.动物体细胞克隆有什么意义？答：动物体细胞克隆技术的成功对生命科学的发展具有重要的推动作用，不仅证明了动物的体细胞具有全能性，而且有巨大的应用前景。例如结合转基因技术生产药物。现在很多药物如胰岛素、生长激素、表皮生长因子等都是动物细胞体内正常的代谢物，某些病人由于产生这些物质的功能发生缺陷，导致了相应疾病的发生，目前的治疗方法就是给这些病人注射这类药物。由于这类药物本身是来自动物的某些脏器，制备这种药物就需要大量的动物提供脏器，因此成本就很高，如果通过转基因技术把相应的基因转入到哺乳动物，让动物的乳汁生产具有疗效的蛋白质就会降低成本，再结合动物体细胞克隆技术，将这种转基因动物大量无性繁殖克隆，就可以大大提高产量，大幅度降低成本，同时也保证了所转基因的稳定。该项技术也可以生产供动物本身和人类器官移植的动物，解决器官捐赠长期缺乏的问题。另外，动物体细胞克隆技术在基因结构和功能、基因治疗、遗传病及人类衰老等的研究方面都具有巨大的潜力。9.蔗糖、甘油和氯化铠都是密度离心分离中的介质，它们在性质上和使用上有什么不同？答：CsCI可自行形成密度梯度，所以不必特别制备密度梯度，只要将待分离的样品与之混匀即可。在离心的过程中，具有不同密度的颗粒随CsCI密度梯度的形成重新分配；而蔗糖和甘油要人工置备密度梯度
6. 什么是细胞培养， 应注意哪些问题? 答：在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。 细胞培养技术是细胞生物学研究方法中最有价值的技术，通过细胞培养可以获得大量的细胞，也可通过细 胞培养研究细胞的运动、细胞的信号传导、细胞的合成代谢等。细胞培养的突出特点是在离体条件下观察 和研究细胞生命活动的规律。培养中的细胞不受体内复杂环境的影响，人为改变培养条件(如物理、化学、 生物等外界因素的变化)即可进一步观察细胞在单因素或多因素的影响下的生理功能变化。然而，细胞在体 外环境的局限性，又使细胞的形态与功能不能与体内的同类细胞完全等同。 体外培养细胞必需注意三个环节∶物质营养、生存环境和废物的排除。 体外培养细胞所需的营养是由培养基提供的。培养基通常含有细胞生长所需的氨基酸、维生素和微量元素。 一般培养细胞所用的培养基是合成培养基，它含有细胞生长必需的营养成分，但是在使用合成培养基时需 要添加一些天然成分，其中最重要的是血清，以牛血清为主。这是因为血清中含有多种促细胞生长因子和 一些生物活性物质。 由于血清中含有一些不明成分，对于特殊目的细胞培养是不利的。为此，研究人员正在探索无血清培养细 胞的条件，并已经取得一些进展。由于机体内的细胞生长通常需要不同的细胞因子进行调节，所以在无血 清培养时仍然需要添加必要的因子，包括：促细胞生长因子(如 EGF)、促贴附物(如层粘连蛋白)和其它活性 物质(如转铁蛋白)。无血清培养排除了有血清培养时血清中不明因素的干扰，使实验结果更加可靠。 体外细胞培养必需模拟体内细胞生长的环境。环境因素主要是指∶无菌环境、合适的温度、一定的渗透压 和气体环境。气体主要有两种∶O2 和 CO2。后者对于维持细胞培养液的酸碱度十分重要。 活体内生长的细胞所产生的代谢物和废物通过一定的系统进行利用和排除。体外培养细胞产生的代谢物和 废物积累在培养液中，所以定期更换培养液，对于体外细胞培养也是至关重要的。 7. 什么是细胞系和细胞株? 答：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系(cell line)， 由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。 如果不能继续传代，或传代次数有限， 可称为有限细胞系(finite cell line)， 如可以连续培养， 则称为连 续细胞系(continuous cell line)， 培养 50 代以上并无限培养下去。 从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株 (cell strain)。所以细胞株是通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的 培养细胞。从培养代数来讲，可培养到 40-50 代。 8. 动物体细胞克隆有什么意义? 答：动物体细胞克隆技术的成功对生命科学的发展具有重要的推动作用，不仅证明了动物的体细胞具有全 能性， 而且有巨大的应用前景。例如结合转基因技术生产药物。现在很多药物如胰岛素、生长激素、表皮 生长因子等都是动物细胞体内正常的代谢物，某些病人由于产生这些物质的功能发生缺陷，导致了相应疾 病的发生，目前的治疗方法就是给这些病人注射这类药物。由于这类药物本身是来自动物的某些脏器，制 备这种药物就需要大量的动物提供脏器，因此成本就很高，如果通过转基因技术把相应的基因转入到哺乳 动物，让动物的乳汁生产具有疗效的蛋白质就会降低成本，再结合动物体细胞克隆技术，将这种转基因动 物大量无性繁殖克隆，就可以大大提高产量，大幅度降低成本，同时也保证了所转基因的稳定。该项技术 也可以生产供动物本身和人类器官移植的动物， 解决器官捐赠长期缺乏的问题。另外，动物体细胞克隆技 术在基因结构和功能、基因治疗、遗传病及人类衰老等的研究方面都具有巨大的潜力。 9. 蔗糖、甘油和氯化铯都是密度离心分离中的介质， 它们在性质上和使用上有什么不同? 答：CsCl 可自行形成密度梯度，所以不必特别制备密度梯度，只要将待分离的样品与之混匀即可。在离心 的过程中，具有不同密度的颗粒随 CsCl 密度梯度的形成重新分配;而蔗糖和甘油要人工置备密度梯度
蔗糖和甘油的最大密度为1.3g/cm3，所以只能用于分离密度在1.3g/cm3以下的细胞器或细胞结构；而氯化的最大密度可达1.9g/cm3以上，可用于分离密度大于1.3g/cm3的DNA分子。在原理上，由于具有不同密度的颗粒随CsCI密度梯度的形成重新分配，所以又称为浮力密度离心(buoyantdensitycentrifugation)；而熊糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于密度的不同而被阻止在不同的部位，故是重力密度离心。10.离子交换层析的原理是什么？答：离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的pH，所以蛋白质的带电性也就依赖于介质的pH。当pH较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多，在pH较高时，蛋白质的电性与低pH时相反。当蛋白质所处的pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的pH称为等电点。离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如DEAE-纤维素树脂：反之称为阳离子交换剂，如CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度便可改变蛋百质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。11.何调乳腺生物反应器，它的出现有什么意义？答：乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物乳腺生物反应器是一项综合技术，发展乳腺生物反应器不仅需要基因工程技术，也需要动物胚胎技术，转基因技术，蛋白质提纯技术和常规畜牧技术，乳腺生物反应器有特殊优点。乳腺生物反应器生产药品，基本上是一个畜牧业过程
蔗糖和甘油的最大密度为 1.3g/cm3 ，所以只能用于分离密度在 1.3g/cm3 以下的细胞器或细胞结构;而氯化 铯的最大密度可达 1.9g/cm3 以上， 可用于分离密度大于 1.3g/cm3 的 DNA 分子。 在原理上， 由于具有不同密度的颗粒随 CsCl 密度梯度的形成重新分配，所以又称为浮力密度离心(buoyant density centrifugation); 而蔗糖和甘油则是在被离心的物质在下降的过程中由于密度的不同而被阻止在不同 的部位，故是重力密度离心。 10. 离子交换层析的原理是什么? 答：离子交换层析是根据蛋白质所带电荷的差异进行分离纯化的一种方法。蛋白质的带电性是由蛋白质多 肽中带电氨基酸决定的。由于蛋白质中氨基酸的电性又取决于介质中的 pH，所以蛋白质的带电性也就依赖 于介质的 pH。当 pH 较低时，负电基团被中和，而正电基团就很多; 在 pH 较高时，蛋白质的电性与低 pH 时相反。当蛋白质所处的 pH，使蛋白质的正负电荷相等，此时的 pH 称为等电点。 离子交换层析所用的交换剂是经酯化、氧化等化学反应引入阳性或阴性离子基团制成的，可与带相反电荷 的蛋白质进行交换吸附。带有阳离子基团的交换剂可置换吸附带负电荷的物质，称为阴离子交换剂，如 DEAE-纤维素树脂;反之称为阳离子交换剂，如 CM-纤维素树脂。不同的蛋白质有不同的等电点，在一定的 条件下解离后所带的电荷种类和电荷量都不同，因而可与不同的离子交换剂以不同的亲和力相互交换吸附。 当缓冲液中的离子基团与结合在离子交换剂上的蛋白质相竞争时，亲和力小的蛋白质分子首先被解吸附而 洗脱，而亲和力大的蛋白质则后被解吸附和洗脱。因此，可通过增加缓冲液的离子强度和/或改变酸碱度， 便可改变蛋白质的吸附状况，使不同亲和力的蛋白质得以分离。 11. 何谓乳腺生物反应器， 它的出现有什么意义? 答：乳腺生物反应器是根据细胞生物学中蛋白质合成与分选的机理，结合基因工程技术、动物转基因技术 等，利用动物的乳腺分泌某些具有重要价值的基因产物。 乳腺生物反应器是一项综合技术，发展乳腺生物反应器不仅需要基因工程技术，也需要动物胚胎技术，转 基因技术，蛋白质提纯技术和常规畜牧技术。 乳腺生物反应器有特殊优点。乳腺生物反应器生产药品，基本上是一个畜牧业过程
设计实验1975年英国科学家Milstein和Kohler发明的单克隆抗体技术(monoclonalantibodytechnique)的实验原理和技术细节有哪些？答：1975年英国科学家Milstein和Kohler发明了单克隆抗体技术,因此获得1984年诺贝尔医学奖。它是将产生抗体的单个B淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术，其原理是：B淋巴细胞能够产生抗体，但在体外不能无限分裂；而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有两种亲本细胞的特性，既能产生抗体，又能无限增殖。图E2-1所示是单克隆抗体制备流程。首先用一种抗原注射小鼠，引起产生特异抗体的细胞大量增殖，取出小鼠的脾，分离产生抗体的淋巴细胞，同骨髓瘤细胞进行融合，在HAT培养基上进行初步筛选后，经过进一步鉴定,得到生产单克隆抗体的细胞。将蛋自质×生入小款实变的鼠骨健猫续购不能在HAT培养基上生长某然游巴细胞开始制造爱白质入特异的抗你混合并进行银腹融合，转到HAT养基→宋耻合888姚购光亡杂合领胸生长强个细陷分开增养+检查等孔中的细雕产生抗X抗体的能力图E2-1单克隆抗体技术筛选用的HAT培养基是选择性培养基，含有氨基噪呤(aminopterin,A)、次黄嘌呤(hypoxanthine,H)和胸腺嘧啶(thymidine,T)。在HAT培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。因为，正常的未融合细胞具有
设计实验 1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明的单克隆抗体技术(monoclonal antibody technique)的实验原理 和技术细节有哪些? 答:1975 年英国科学家 Milstein 和 Kohler 发明了单克隆抗体技术,因此获得 1984 年诺贝尔医学奖。它是将产 生抗体的单个 B 淋巴细胞同肿瘤细胞杂交的技术，其原理是: B 淋巴细胞能够产生抗体, 但在体外不能无限 分裂;而瘤细胞虽然可以在体外进行无限传代,但不能产生抗体。将这两种细胞融合后得到的杂交瘤细胞具有 两种亲本细胞的特性, 既能产生抗体,又能无限增殖。 图 E2-1 所示是单克隆抗体制备流程。首先用一种抗原注射小鼠，引起产生特异抗体的细胞大量增殖,取出 小鼠的脾,分离产生抗体的淋巴细胞，同骨髓瘤细胞进行融合，在 HAT 培养基上进行初步筛选后，经过进 一步鉴定,得到生产单克隆抗体的细胞。 图 E 2 - 1 单 克 隆 抗 体 技 术 筛选用的 HAT 培养基是选择性培养基，含有氨基喋呤(aminopterin,A)、次黄嘌呤(hypoxanthine,H) 和胸腺嘧 啶(thymidine,T)。在 HAT 培养基中，只有肿瘤细胞和正常细胞融合形成的杂交瘤细胞才能生存，而未融合 的肿瘤细胞、正常细胞及非肿瘤细胞和正常细胞融合形成的细胞都会死亡。因为，正常的未融合细胞具有
核酸合成主要通路和旁路所必需的酶但不能在体外长期生长：突变后的肿瘤细胞只具有RNA和DNA合成所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成DNA的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黄嘌呤合成RNA的磷酸核糖转移酶(HGPRT)。当这些细胞的核酸合成主通路被培养基中氨基噪呤阻断后，则因核酸合成障碍而死亡。只有肿瘤细胞和具有合成旁路酶的正常细胞形成的融合细胞，才能在氨基噪呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下利用其中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。由于融合细胞具有肿瘤细胞和抗体分泌细胞双重特征，所以在去除氨基噪呤这一核酸阻断剂后即可在正常培养基中长期传代增殖，并分泌抗体。在HAT培养基中生存下来的细胞，可以是各种正常细胞与瘤细胞的融合体，还可能是多克隆杂交瘤细胞的混合群体，因此须进一步用稀释法分离出单克隆的杂交瘤细胞和筛选出识别特异性抗原的抗体分泌克隆，才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株
核酸合成主要通路和旁路所必需的酶但不能在体外长期生长；突变后的肿瘤细胞只具有 RNA 和 DNA 合 成所必需的主通路的酶，而缺乏利用胸腺嘧啶核苷合成 DNA 的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)或缺乏利用次黄嘌 呤合成 RNA 的磷酸核糖转移酶(HGPRT)。当这些细胞的核酸合成主通路被培养基中氨基喋呤阻断后，则 因核酸合成障碍而死亡。只有肿瘤细胞和具有合成旁路酶的正常细胞形成的融合细胞，才能在氨基喋呤、 次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷存在的情况下利用其中的次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷合成核酸而得以生存。由于融 合细胞具有肿瘤细胞和抗体分泌细胞双重特征，所以在去除氨基喋呤这一核酸阻断剂后即可在正常培养基 中长期传代增殖，并分泌抗体。在 HAT 培养基中生存下来的细胞，可以是各种正常细胞与瘤细胞的融合 体，还可能是多克隆杂交瘤细胞的混合群体，因此须进一步用稀释法分离出单克隆的杂交瘤细胞和筛选出 识别特异性抗原的抗体分泌克隆，才能最终得到特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株
第三章：细胞质膜与跨膜运输学习指导一、主要内容本章从以下5个方面讨论了细胞质膜的结构和运输功能1.概述4.膜的分子结构及特点2.红细胞膜结构5.物质的跨膜运输3.质膜的化学组成二、计划学时及安排本章计划5学时：1~3节2学时，第5节2学时三、学习的重点和难点1．细胞质膜(plasmamembrane)是指包围在细胞表面的一层极薄的膜，主要由膜脂和膜蛋白所组成。质膜的基本作用是维护细胞内微环境的相对稳定,并参与同外界环境进行物质交换、能量和信息传递。另外，在细胞的生存、生长、分裂、分化中起重要作用。本章的核心内容是学习和讨论质膜的结构和运输功能。2．成熟的红细胞没有细胞器，质膜是惟一的结构，并且易于提纯和分离，是研究膜结构的最好材料。人们对膜结构的认识，大多来自手对红细胞膜结构的研究。重点学习红细胞质膜的脂双层的实验、红细胞的膜骨架组成。构成膜的三大成分是脂、蛋白质和糖类。要了解膜脂的主要类型、特性和功能；脂3.质体的制备和作用。蛋白质是膜功能的体现者，要掌握膜蛋白在膜上的存在方式、膜蛋白的功能和膜蛋白的研究方法。对于膜糖的学习重点是膜糖的存在方式、膜糖的功能。4．膜的分子结构及特点是本章核心内容之一。主要掌握流动镶嵌模型的结构特点，即不对称性和流动性。在不对称性方面，重点掌握不对称性的表现、不对称性的意义和研究方法。在膜的流动性方面，重点是流动性的表现形式、膜流动性的生理意义、膜流动性的研究方法、影响流动性的因素等。5.物质的跨膜运输是本章的另一个核心内容，理解扩散与渗透、分清被动运输与主动运输的主要特点。对于被动运输，掌握简单扩、促进扩散及其特点。特别掌握通道蛋白、载体蛋白在被动运输中的作用。对于主动运输，要掌握主动运输的特点和参与主动运输的运输ATPase，包括P型离子泵、V型泵、F型泵。并注意主动运输与被动运输的比较、动物细胞和植物细胞主动运输的比较
第三章：细胞质膜与跨膜运输 学习指导 一、主要内容 本章从以下 5 个方面讨论了细胞质膜的结构和运输功能: 1. 概述 2. 红细胞膜结构 3. 质膜的化学组成 4. 膜的分子结构及特点 5. 物质的跨膜运输 二、计划学时及安排 本章计划 5 学时: 1～3 节 2 学时，第 5 节 2 学时 三、学习的重点和难点 1. 细胞质膜(plasma membrane)是指包围在细胞表面的一层极薄的膜，主要由膜脂和膜 蛋白所组成。质膜的基本作用是维护细胞内微环境的相对稳定,并参与同外界环境 进行物质交换、能量和信息传递。另外, 在细胞的生存、生长、分裂、分化中起重 要作用。本章的核心内容是学习和讨论质膜的结构和运输功能。 2. 成熟的红细胞没有细胞器，质膜是惟一的结构，并且易于提纯和分离，是研究膜结 构的最好材料。人们对膜结构的认识，大多来自于对红细胞膜结构的研究。重点学 习红细胞质膜的脂双层的实验、红细胞的膜骨架组成。 3. 构成膜的三大成分是脂、蛋白质和糖类。要了解膜脂的主要类型、特性和功能；脂 质体的制备和作用。蛋白质是膜功能的体现者，要掌握膜蛋白在膜上的存在方式、 膜蛋白的功能和膜蛋白的研究方法。对于膜糖的学习重点是膜糖的存在方式、膜糖 的功能。 4. 膜的分子结构及特点是本章核心内容之一。主要掌握流动镶嵌模型的结构特点, 即 不对称性和流动性。在不对称性方面, 重点掌握不对称性的表现、不对称性的意义 和研究方法。在膜的流动性方面, 重点是流动性的表现形式、膜流动性的生理意义、 膜流动性的研究方法、影响流动性的因素等。 5. 物质的跨膜运输是本章的另一个核心内容, 理解扩散与渗透、分清被动运输与主动 运输的主要特点。对于被动运输, 掌握简单扩、促进扩散及其特点。特别掌握通道 蛋白、载体蛋白在被动运输中的作用。对于主动运输, 要掌握主动运输的特点和参 与主动运输的运输 ATPase, 包括 P 型离子泵、V 型泵、F 型泵。并注意主动运输与 被动运输的比较、动物细胞和植物细胞主动运输的比较