键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分确证，一般应进行 以下几方面的考察： 1、特异性(Specificity) 特异性是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专 一地测定分析物的能力。必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特 定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干 扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。 应确定保证分析方法的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察6个不同个体 的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度） 及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质 谱为基础的检测法(LC-MS、LC-MS-MS)应注意考察分析过程中的介质效 应，如离子抑制等。 2、标准曲线和定量范围(Calibration Curve) 标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回 归分析法（如用加权最小二乘法等）所得的回归方程来评价。应提供标准 曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度。标准曲线高低浓度范 围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准 确度。 配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，测定不同生物样品应 建立各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可 能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。必须至少用6个浓度建立标准 曲线，对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测
键之一。为了保证分析方法可靠，必须对方法进行充分确证，一般应进行 以下几方面的考察： 1、特异性(Specificity) 特异性是指在样品中存在干扰成分的情况下，分析方法能够准确、专 一地测定分析物的能力。必须证明所测定物质是受试药品的原形药物或特 定活性代谢物，生物样品所含内源性物质和相应代谢物、降解产物不得干 扰对样品的测定，如果有几个分析物，应保证每一个分析物都不被干扰。 应确定保证分析方法的最佳检测条件。对于色谱法至少要考察6个不同个体 的空白生物样品色谱图、空白生物样品外加对照物质色谱图（注明浓度） 及用药后的生物样品色谱图，以反映分析方法的特异性。对于以软电离质 谱为基础的检测法（LC-MS、LC-MS-MS）应注意考察分析过程中的介质效 应，如离子抑制等。 2、标准曲线和定量范围（Calibration Curve） 标准曲线反映了所测定物质浓度与仪器响应值之间的关系，一般用回 归分析法（如用加权最小二乘法等）所得的回归方程来评价。应提供标准 曲线的线性方程和相关系数，说明其线性相关程度。标准曲线高低浓度范 围为定量范围，在定量范围内浓度测定结果应达到试验要求的精密度和准 确度。 配制标准样品应使用与待测样品相同生物介质，测定不同生物样品应 建立各自的标准曲线，用于建立标准曲线的标准浓度个数取决于分析物可 能的浓度范围和分析物/响应值关系的性质。必须至少用6个浓度建立标准 曲线，对于非线性相关可能需要更多浓度点。定量范围要能覆盖全部待测 3
的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。 建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点，仅用于评价 干扰。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差在可接受的范围之 内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在 ±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对 临床待测样品进行定量计算。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方 法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。 3、定量下限(Lower Limit of quantitation,LLOQ) 定量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和 精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3~5个消除半衰期时样品 中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10~1/20的药物浓度。其准确度应在真 实浓度的80%~120%范围内，相对标准差RSD)应小于20%。至少应由5个标 准样品测试结果证明。 4、精密度与准确度（Precision and Accuracy). 精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列 测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间相对标准差(RSD)来考 察方法的精密度。一般RSD应小于15%，在LLOQ附近RSD应小于20%。 准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的 接近程度（即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差），重复测定已知浓度分 析物样品可获得准确度。一般应在85%~115%范围内（一般偏差应少于15 6),在LLOQ附近应在80%~120%范围内。 ·:偏差=【（实测值-标示值）标示值】X100%
的生物样品浓度范围，不得用定量范围外推的方法求算未知样品的浓度。 建立标准曲线时应随行空白生物样品，但计算时不包括该点，仅用于评价 干扰。标准曲线各浓度点的实测值与标示值之间的偏差* 在可接受的范围之 内时，可判定标准曲线合格。可接受范围一般规定为最低浓度点的偏差在 ±20%以内，其余浓度点的偏差在±15%以内。只有合格的标准曲线才能对 临床待测样品进行定量计算。当线性范围较宽的时候，推荐采用加权的方 法对标准曲线进行计算，以使低浓度点计算得比较准确。 3、定量下限（Lower Limit of quantitation，LLOQ） 定量下限是标准曲线上的最低浓度点，表示测定样品中符合准确度和 精密度要求的最低药物浓度。LLOQ应能满足测定3～5个消除半衰期时样品 中的药物浓度或能检测出Cmax的1/10～1/20的药物浓度。其准确度应在真 实浓度的80%～120%范围内，相对标准差(RSD)应小于20%。至少应由5个标 准样品测试结果证明。 4、精密度与准确度（Precision and Accuracy） 精密度是指在确定的分析条件下，相同介质中相同浓度样品的一系列 测量值的分散程度。通常用质控样品的批内和批间相对标准差（RSD）来考 察方法的精密度。一般RSD应小于15％，在LLOQ附近RSD应小于20％。 准确度是指在确定的分析条件下，测得的生物样品浓度与真实浓度的 接近程度(即质控样品的实测浓度与真实浓度的偏差)，重复测定已知浓度分 析物样品可获得准确度。一般应在85％～115％范围内(一般偏差应少于15 ％)，在LLOQ附近应在80％～120％范围内。 * ：偏差=【（实测值－标示值）/标示值】X100% 4
一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和 准确度考察。低浓度通常选择在LLOQ的3倍以内；高浓度接近于标准曲线 的上限；中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测 定5个样品。为获得批间精密度，应在不同天连续制备并测定，至少有连续 3个分析批（不少于45个样品)的结果合格。 5、样品稳定性(Stability) 根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同 存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品稳定的存放条件和时间，应在 确保样品稳定的条件下进行测定。还应注意考察储备液的稳定性以及样品 处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。 6、提取回收率 从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以标准品产生的响应 值即为分析物的提取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出 来供分析的比例。考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密并 具有可重现性。 7、微生物学和免疫学方法确证 上述分析方法确证主要针对色谱法，很多参数和原则也适用于微生物 学或免疫学分析，但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物 学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以，应尽可能采用比化 学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键因素，如果重 复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步 骤
一般要求选择高、中、低3个浓度的质控样品同时进行方法的精密度和 准确度考察。低浓度通常选择在LLOQ的3倍以内；高浓度接近于标准曲线 的上限；中间选一个浓度。在测定批内精密度时，每一浓度至少制备并测 定5个样品。为获得批间精密度，应在不同天连续制备并测定，至少有连续 3个分析批（不少于45个样品）的结果合格。 5、样品稳定性(Stability) 根据具体情况，对含药生物样品在室温、冰冻和冻融条件下以及不同 存放时间进行稳定性考察，以确定生物样品稳定的存放条件和时间，应在 确保样品稳定的条件下进行测定。还应注意考察储备液的稳定性以及样品 处理后的溶液中分析物的稳定性，以保证检测结果的准确性和重现性。 6、提取回收率 从生物样本基质中回收得到分析物质的响应值除以标准品产生的响应 值即为分析物的提取回收率。也可以说是将供试生物样品中分析物提取出 来供分析的比例。考察高、中、低3个浓度的提取回收率，其结果应精密并 具有可重现性。 7、微生物学和免疫学方法确证 上述分析方法确证主要针对色谱法，很多参数和原则也适用于微生物 学或免疫学分析，但在方法确证中应考虑到它们的一些特殊之处。微生物 学或免疫学分析的标准曲线本质上是非线性的，所以，应尽可能采用比化 学分析更多的浓度点来建立标准曲线。结果的准确度是关键因素，如果重 复测定能够改善准确度，则应在方法确证和未知样品测定中采用同样的步 骤。 5