《工业微生物学》 实罐灭菌需要较长时间在罐内加热和冷却培养基,如一个50m3的发酵罐,装料 35m3,从预热到消后冷却,就需要8小时左右。这段时间发酵罐不能用于发酵,所以, 实罐灭菌的设备利用率要低于连续灭菌。由于实罐灭菌是间歇性操作,蒸汽负荷高峰相 对集中,这也将给蒸汽的供应系统带来一定的困难。然而,实罐灭菌的操作比较简单, 染菌的机会较少,而且当采用较低的冷却温度和较大的冷却面积时,对培养基的质量影 响较小。 为了降低高温对培养基成分的破坏,在设计批式灭菌的工序时,应该将升温和降温 过程也考虑进去,即Del系数a=Del升a+Dl+Del恒温期。 Del系数随发酵罐体积增大而增大。为达到较高的Del系数而增加恒温时间将会增 加养分的破坏,而且,随着规模的增大,升温和降温过程对养分的破坏将会加剧。这是 批式灭菌的规模增大会造成产量下降的原因之一。较好的解决方法是采用连续灭菌法。 5)连续灭菌法( continous sterilization) 在考察Del系数时,显然可见采用高温瞬时灭菌将更有利于达到灭菌目的,而且大 大降低了对培养基成分的破坏。有人做过试验,将芽孢和维生素在高压下加热,当温度 为118℃,加热时间为15分钟时,杀死9999%芽孢,维生素的破坏率为10%;而当加 热温度为128℃,时间1.5分钟时,芽孢同样可杀死999%,维生素的破坏率却下降为 5%。所以,理想的手段是将培养基瞬间升温,然后迅速降温至发酵温度。但是,实际操 作中将一大罐原料迅速加热到髙温,持续片刻后又迅速冷却显然是不可能的。能实现短 时高温灭菌效果的唯一可行方法是流动式连续灭菌。就是将培养基在发酵罐外按需要连 续不断地加热、保温和冷却,然后送入发酵罐内。一般采用135~140℃、5~15秒短暂的 加热过程,然后需要在维持罐内继续保温5-8分钟,以达到彻底灭菌的目的。输送培养 基泵的出口压力一般为6公斤厘米2,所以总蒸汽压力要求达到45~50公斤/厘米2以 上。两者压力接近时才能使培养基的流速维持均匀稳定,否则,流速的变化将影响灭菌 的效果。连续加压灭菌既达到了灭菌的目的,又减少了营养物质的损失。同时,总的灭 菌时间减少了,还能提高发酵罐的利用率。操作过程的劳动强度低,适合采用自动化操 典型的培养基的连续灭菌的流程见图3.5.5。 冷却水 物料和水 蒸汽 AAA无菌培养基 送入发酵罐 配料罐预热罐灭菌器维持罐冷却器 60~75c°)(1300°10-12秒)(保温5~8分钟) 图355培养基连续灭菌示意图 6尽 图536双层螺旋型换热器 早期的连续灭菌器是由一些板式换热器组成的。它们存在两大不足。一是若平板间
《工业微生物学》 第三章 6 实罐灭菌需要较长时间在罐内加热和冷却培养基，如一个 50m3 的发酵罐，装料 35m3，从预热到消后冷却，就需要 8 小时左右。这段时间发酵罐不能用于发酵，所以， 实罐灭菌的设备利用率要低于连续灭菌。由于实罐灭菌是间歇性操作，蒸汽负荷高峰相 对集中，这也将给蒸汽的供应系统带来一定的困难。然而，实罐灭菌的操作比较简单， 染菌的机会较少，而且当采用较低的冷却温度和较大的冷却面积时，对培养基的质量影 响较小。 为了降低高温对培养基成分的破坏，在设计批式灭菌的工序时，应该将升温和降温 过程也考虑进去，即 Del 系数总 = Del 升温 + Del 冷却 + Del 恒温期 。 Del 系数随发酵罐体积增大而增大。为达到较高的 Del 系数而增加恒温时间将会增 加养分的破坏，而且，随着规模的增大，升温和降温过程对养分的破坏将会加剧。这是 批式灭菌的规模增大会造成产量下降的原因之一。较好的解决方法是采用连续灭菌法。 5) 连续灭菌法( continous sterilization) 在考察 Del 系数时，显然可见采用高温瞬时灭菌将更有利于达到灭菌目的，而且大 大降低了对培养基成分的破坏。有人做过试验，将芽孢和维生素在高压下加热，当温度 为 118℃，加热时间为 15 分钟时，杀死 99.99%芽孢，维生素的破坏率为 10%；而当加 热温度为 128℃，时间 1.5 分钟时，芽孢同样可杀死 99.99%，维生素的破坏率却下降为 5%。所以，理想的手段是将培养基瞬间升温，然后迅速降温至发酵温度。但是，实际操 作中将一大罐原料迅速加热到高温，持续片刻后又迅速冷却显然是不可能的。能实现短 时高温灭菌效果的唯一可行方法是流动式连续灭菌。就是将培养基在发酵罐外按需要连 续不断地加热、保温和冷却，然后送入发酵罐内。一般采用 135~140℃、5~15 秒短暂的 加热过程，然后需要在维持罐内继续保温 5~8 分钟，以达到彻底灭菌的目的。输送培养 基泵的出口压力一般为 6 公斤/厘米 2，所以总蒸汽压力要求达到 4.5~5.0 公斤/厘米 2 以 上。两者压力接近时才能使培养基的流速维持均匀稳定，否则，流速的变化将影响灭菌 的效果。连续加压灭菌既达到了灭菌的目的，又减少了营养物质的损失。同时，总的灭 菌时间减少了，还能提高发酵罐的利用率。操作过程的劳动强度低，适合采用自动化操 作。 典型的培养基的连续灭菌的流程见图 3.5.5。 图 3.5.5 培养基连续灭菌示意图 图 5.3.6 双层螺旋型换热器 早期的连续灭菌器是由一些板式换热器组成的。它们存在两大不足。一是若平板间
《工业微生物学》第三章 的填料出现故障将会造成已消毒的蒸汽和未消毒的蒸汽混合:二是培养基中的颗粒成分 会堵塞换热器。现代的连续灭菌器是双层螺旋型换热器,见图53.6。两层不锈钢薄板 围绕中轴旋转形成两层平行的螺旋通道。螺旋通道的末端被封闭。为达到灭菌温度,蒸 汽通过其中一层螺旋通道,而培养基逆流通过另一层螺旋通道。螺旋换热器也可作为冷 却器用于流岀培养基的冷却。而配料罐流出的培养基在注入灭菌器前可作为第一冷却器 的冷源而被预热,省略了预热罐。同时使流岀的培养基得到一定的冷却。这种换热器能 保证两股流体分开,而且,不易被颗粒堵塞。恒温的时间由蛇管的长度和培养基的流速 来调控 连续处理过程主要优点是可以使用一个较高的灭菌温度和较短的恒温时间,所以养 分损失较小。连续灭菌过程中培养基是一点点加入的,所以相对于批式灭菌系统其升温 和降温所需的时间也较短。但是,批式灭菌与连续灭菌法相比仍有它的优势,如(1) 设备投资省。连续灭菌需要较高的控制精度,需要较为成熟的计算机控制系统;(2)受 污染的风险小,因为连续灭菌时必须将无菌发酵液通过无菌操作输送到发酵罐中;(3)更 易于人工控制:(4)便于对固体成分较高的培养基进行灭菌。所以,目前连续灭菌只是 种供选用的灭菌方法,批式灭菌仍被大多数发酵企业所采用。 发酵过程中需要添加各种各样添加剂。对添加剂灭菌的方法应依其性质、体积和进 料速度而定。如果,添加剂是以大剂量进料,那需要采用连续灭菌法。一般采取将蒸汽 通入补料的储罐进行批式灭菌。如糖水罐灭菌的压力1Kgcm2,时间30分钟左右。油(消 泡剂)罐灭菌的压力1.5~1.8Kg/cm2,时间60分钟。灭菌时,糖水要翻腾良好,但温度 不能过高,否则,将使糖分大量破坏。不论采用哪种灭菌法,都需对进料的辅助设备和 管路进行灭菌。一般都应灭菌保温60分钟。 生产用的大多数微生物存在“异种”基因,所以,它们将受到严格的污染控制。这 些微生物发酵的废液在排放之前必须灭活。灭活可采取分批或连续法。批式操作是将蒸 汽通入恒温槽中。连续法是采用前面讨论过的热交换器。无论哪种方法,处理液都要冷 却到60℃以下再倾倒。 虽然,高温是有效的灭菌手段,但是,它也对被灭菌物品带来以下一些不利的影响 有机物多肽类沉淀 高温灭菌的「形成沉淀物(无机物磷酸盐、碳酸盐沉淀 不利影响 破坏营养成分(产生氨基糖、焦糖和黑色素) 改变pH值 (一般会降低pH值) 降低培养基浓度(冷凝水的聚集) 髙温灭菌过程对培养基的破坏主要有两种情况:造成培养基成分相互作用:造成 热稳定性差的化学成分的破坏 前者在降低培养基质量的同时,还会引起培养基变色、沉淀。变色反应一般是由来 自还原糖的羰基与氨基酸和蛋白质中的氨基反应而引起的。在加热情况下,培养基中 Ca2、Fe3等成分易与磷酸盐发生沉淀反应。 后者使某些维生素、氨基酸、蛋白质和糖等遭到破坏。例如:10%的葡萄糖溶液经 21℃灭菌15分钟后,会被破坏24% 在某些特殊情况下,可采取过滤除菌等方法。然而,对于大多数发酵过程,以上问 题都可以通过选择合适的灭菌条件加以解决 (1)分开灭菌对培养基中糖类等不耐高温的成分与培养基其它成分分开灭菌,冷却后 再混合。将培养基中Ca2-、Fe3成分与磷酸盐分别灭菌,以免发生沉淀反应 (2)低温灭菌葡萄糖经过112℃(0.75Kgcm2,或8磅/in2)灭菌l5分钟,只会破坏了 0.60%。所以,对这些成分可通过降低灭菌温度或缩短灭菌时间,尽可能减少损失。 (3)间歇灭菌采用丁达尔灭菌法 (4)连续灭菌连续灭菌可以缩短灭菌的时间,减少营养成分的损失。 在实际工作中,无论采用哪种灭菌的方法,都不能也没有必要做到理论上的彻底无
《工业微生物学》 第三章 7 的填料出现故障将会造成已消毒的蒸汽和未消毒的蒸汽混合；二是培养基中的颗粒成分 会堵塞换热器。现代的连续灭菌器是双层螺旋型换热器，见图 5.3.6 。两层不锈钢薄板， 围绕中轴旋转形成两层平行的螺旋通道。螺旋通道的末端被封闭。为达到灭菌温度，蒸 汽通过其中一层螺旋通道，而培养基逆流通过另一层螺旋通道。螺旋换热器也可作为冷 却器用于流出培养基的冷却。而配料罐流出的培养基在注入灭菌器前可作为第一冷却器 的冷源而被预热，省略了预热罐。同时使流出的培养基得到一定的冷却。这种换热器能 保证两股流体分开，而且，不易被颗粒堵塞。恒温的时间由蛇管的长度和培养基的流速 来调控。 连续处理过程主要优点是可以使用一个较高的灭菌温度和较短的恒温时间，所以养 分损失较小。连续灭菌过程中培养基是一点点加入的，所以相对于批式灭菌系统其升温 和降温所需的时间也较短。但是，批式灭菌与连续灭菌法相比仍有它的优势，如（1） 设备投资省。连续灭菌需要较高的控制精度，需要较为成熟的计算机控制系统；(2 ) 受 污染的风险小，因为连续灭菌时必须将无菌发酵液通过无菌操作输送到发酵罐中；(3) 更 易于人工控制；(4) 便于对固体成分较高的培养基进行灭菌。所以，目前连续灭菌只是 一种供选用的灭菌方法，批式灭菌仍被大多数发酵企业所采用。 发酵过程中需要添加各种各样添加剂。对添加剂灭菌的方法应依其性质、体积和进 料速度而定。如果，添加剂是以大剂量进料，那需要采用连续灭菌法。一般采取将蒸汽 通入补料的储罐进行批式灭菌。如糖水罐灭菌的压力 1Kg/cm2，时间 30 分钟左右。油（消 泡剂）罐灭菌的压力 1.5~1.8Kg/cm2，时间 60 分钟。灭菌时，糖水要翻腾良好，但温度 不能过高，否则，将使糖分大量破坏。.不论采用哪种灭菌法，都需对进料的辅助设备和 管路进行灭菌。一般都应灭菌保温 60 分钟。 生产用的大多数微生物存在“异种”基因，所以，它们将受到严格的污染控制。这 些微生物发酵的废液在排放之前必须灭活。灭活可采取分批或连续法。批式操作是将蒸 汽通入恒温槽中。连续法是采用前面讨论过的热交换器。无论哪种方法，处理液都要冷 却到 60℃以下再倾倒。 虽然，高温是有效的灭菌手段，但是，它也对被灭菌物品带来以下一些不利的影响： 高温灭菌过程对培养基的破坏主要有两种情况：造成培养基成分相互作用；造成 热稳定性差的化学成分的破坏。 前者在降低培养基质量的同时，还会引起培养基变色、沉淀。变色反应一般是由来 自还原糖的羰基与氨基酸和蛋白质中的氨基反应而引起的。在加热情况下，培养基中 Ca2+、Fe3+等成分易与磷酸盐发生沉淀反应。 后者使某些维生素、氨基酸、蛋白质和糖等遭到破坏。例如：10%的葡萄糖溶液经 121℃灭菌 15 分钟后，会被破坏 24%。 在某些特殊情况下，可采取过滤除菌等方法。然而，对于大多数发酵过程，以上问 题都可以通过选择合适的灭菌条件加以解决： (1) 分开灭菌 对培养基中糖类等不耐高温的成分与培养基其它成分分开灭菌，冷却后 再混合。将培养基中 Ca2+、Fe3+成分与磷酸盐分别灭菌，以免发生沉淀反应。 (2) 低温灭菌 葡萄糖经过 112℃（0.75Kg/cm2 ,或 8 磅/in2 ）灭菌 15 分钟，只会破坏了 0.60%。所以，对这些成分可通过降低灭菌温度或缩短灭菌时间，尽可能减少损失。 (3) 间歇灭菌 采用丁达尔灭菌法。 (4) 连续灭菌 连续灭菌可以缩短灭菌的时间，减少营养成分的损失。 在实际工作中，无论采用哪种灭菌的方法，都不能也没有必要做到理论上的彻底无 有机物 多肽类沉淀 高温灭菌的 形成沉淀物 无机物 磷酸盐、碳酸盐沉淀 不利影响 破坏营养成分 （ 产生氨基糖、焦糖和黑色素） 改变 pH 值 （ 一般会降低 pH 值） 降低培养基浓度 （ 冷凝水的聚集）
《工业微生物学》 菌。对发酵工业而言,只要做到染杂菌的概率在1%以下,就可满足发酵的基本要求。 过高的灭菌指标往往造成营养物的过度损失、能耗及其它操作成本的增加。 3513过滤除菌法( filter sterilization) 过滤器主要有两类。一类是绝对过滤器( absolute filter),过滤介质呈膜状,其滤孔比 要除去的颗粒的直径小。理论上可以100%除去微生物;另一类是深层过滤器( deptl fitr),其空隙的直径比要除去的颗粒的直径大。它们由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维等 组成。“绝对”和“深层”术语的描述并不准确。因为绝对过滤器的过滤作用并不只发 生在过滤器的表面,其实它也有一定厚度,过滤器的内部与表面一样有过滤作用。因此, 有人将前者称为固定孔过滤器( fixed pore filter)),其空隙的孔径均一;后者称为非固定孔 过滤器( non-fixed pore filter)),其空隙的孔径不均一。绝对过滤器去除颗粒的主要机理是 拦截作用( Interception)。可以通过控制孔的大小来保证除去一定大小范围的颗粒。因为 也有一定的厚度,所以,也可通过惯性碰撞( inertial impaction)、扩散( diffusion)和吸附 ( electrostatic attraction)等作用去除比孔径小的颗粒。这些作用在空气过滤时显得格外重 要。绝对过滤器的主要缺点是流动阻力会造成巨大的压力降。采用带许多皱褶的薄膜可 以增大表面积,从而减小压力降。深层过滤器主要工作机理是通过惯性碰撞、扩散和吸 附等作用除菌,而非拦截作用。从理论上讲,它不可能绝对地去除所有的颗粒。深层过 滤介质可分为两类。一类如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等,它们要 填充在一定的容器中定形:另一类已制成板或管状。如石棉板和烧结材料等。这些材料 的除菌效率比前一类高。 1)培养基的过滤除菌 对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基,无法采用高温灭菌法,但 可以通过过滤手段除去菌体。过滤介质有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚 丙烯腈、聚丙烯、聚偏氟乙烯等膜材料,也有石棉板、烧结陶瓷和烧结金属等深层过滤 材料。实验室中常用察氏( Seitz)滤器和一些膜过滤器,见图3.5.7。 待灭菌培养基 褚液杯 今分石棉板 固定夹 固定架 ←一滤膜 沙芯垫台 ◎橡胶塞 接真空泵 收集瓶 无菌培养基 图357实验室用过滤除菌装置1经典的察氏过滤器;2目前常见的膜过滤器 实验室常用滤器的孔径是045μm和0.22um。可以拦截细菌、放线菌、酵母和霉 菌等通过。图358是采用醋酸纤维素膜过滤器所拦截的大肠杆菌。常用的过滤器一般 无法去除病毒。如果有必要,可使用孔径θ.04μm的过滤器去除病毒。通常情况下,可 将一系列不同的滤器组合使用。如用于制备无菌、无支原体的血清过滤系统。它包括四 个按顺序安装的过滤器。第一道过滤器是带正电的聚丙烯膜过滤器,其直径5μm,用 于去除粗糙的沉淀物、块状物等。第二道也是带正电的聚丙烯膜过滤器,其直径0.5μm 可以去除大部分微生物和脂类物质等。第三道是带正电的单层尼龙/聚酯膜过滤器,其孔 径0.lum,可进一步去除微生物和内毒素。第四道过滤器与第三道相似,但它是双层 结构,可以去除支原体,并保证绝对无菌。联合使用多级过滤器可以延长昂贵的小孔径
《工业微生物学》 第三章 8 菌。对发酵工业而言，只要做到染杂菌的概率在 1%以下，就可满足发酵的基本要求。 过高的灭菌指标往往造成营养物的过度损失、能耗及其它操作成本的增加。 3.5.1.3 过滤除菌法(filter sterilization) 过滤器主要有两类。一类是绝对过滤器(absolute filter)，过滤介质呈膜状，其滤孔比 要除去的颗粒的直径小。理论上可以 100%除去微生物；另一类是深层过滤器(depth filter)，其空隙的直径比要除去的颗粒的直径大。它们由毡毛、棉花、石棉和玻璃纤维等 组成。“绝对”和“深层”术语的描述并不准确。因为绝对过滤器的过滤作用并不只发 生在过滤器的表面，其实它也有一定厚度，过滤器的内部与表面一样有过滤作用。因此， 有人将前者称为固定孔过滤器(fixed pore filter)，其空隙的孔径均一；后者称为非固定孔 过滤器(non-fixed pore filter)，其空隙的孔径不均一。绝对过滤器去除颗粒的主要机理是 拦截作用(interception)。可以通过控制孔的大小来保证除去一定大小范围的颗粒。因为 也有一定的厚度，所以，也可通过惯性碰撞(inertial impaction)、扩散(diffusion)和吸附 (electrostatic attraction)等作用去除比孔径小的颗粒。这些作用在空气过滤时显得格外重 要。绝对过滤器的主要缺点是流动阻力会造成巨大的压力降。采用带许多皱褶的薄膜可 以增大表面积，从而减小压力降。深层过滤器主要工作机理是通过惯性碰撞、扩散和吸 附等作用除菌，而非拦截作用。从理论上讲，它不可能绝对地去除所有的颗粒。深层过 滤介质可分为两类。一类如棉花纤维、玻璃纤维、合成纤维和颗粒状活性炭等，它们要 填充在一定的容器中定形；另一类已制成板或管状。如石棉板和烧结材料等。这些材料 的除菌效率比前一类高。 1)培养基的过滤除菌 对于含酶、血清、维生素和氨基酸等热敏物质的培养基，无法采用高温灭菌法，但 可以通过过滤手段除去菌体。过滤介质有醋酸纤维素、硝酸纤维素、聚醚砜、尼龙、聚 丙烯腈、聚丙烯、聚偏氟乙烯等膜材料，也有石棉板、烧结陶瓷和烧结金属等深层过滤 材料。实验室中常用察氏（Seitz）滤器和一些膜过滤器，见图 3.5.7。 图 3.5.7 实验室用过滤除菌装置 1.经典的察氏过滤器；2.目前常见的膜过滤器 实验室常用滤器的孔径是 0.45m 和 0.22m 。可以拦截细菌、放线菌、酵母和霉 菌等通过。图 3.5.8 是采用醋酸纤维素膜过滤器所拦截的大肠杆菌。常用的过滤器一般 无法去除病毒。如果有必要，可使用孔径 0.04m 的过滤器去除病毒。通常情况下，可 将一系列不同的滤器组合使用。如用于制备无菌、无支原体的血清过滤系统。它包括四 个按顺序安装的过滤器。第一道过滤器是带正电的聚丙烯膜过滤器，其直径 5m ，用 于去除粗糙的沉淀物、块状物等。第二道也是带正电的聚丙烯膜过滤器，其直径 0.5m 。 可以去除大部分微生物和脂类物质等。第三道是带正电的单层尼龙/聚酯膜过滤器，其孔 径 0.1m ，可进一步去除微生物和内毒素。第四道过滤器与第三道相似，但它是双层 结构，可以去除支原体，并保证绝对无菌。联合使用多级过滤器可以延长昂贵的小孔径