二、 发酵液的过滤 微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。 1，影响过滤速度的因素 过滤速度和以下因素有关 ①菌种； ②发酵条件（培养基的组成、未用完培养基的数量、消沫油、发酵周期、）。 （1）菌种对过滤速度影响 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达 10ìm，发酵液容易过滤，不需 特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤 机过滤。 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅 0.5~1.0ìm 左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋 白质等胶体。 细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发 酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。 （2）培养基的组成对过滤速度影响 用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难； 发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。 （3）发酵周期对过滤的影响 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞 自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但 严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。 2，改善过滤性能的方法 发酵工业中用于改善发酵液过滤性能的方法通常有：等电点、蛋白质变性、吸 附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、直接在发酵液中形成填充-凝固剂、酶解作用。 （1）过滤助剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。 过滤助剂可解决两个问题 ①滤饼的可压缩性问题 ②小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得 预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题 常用的过滤助剂有：硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉 助滤剂的加入有两种方法： ①在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)，该方法，会使滤速降低，但滤液透明 度 ②直接加入发酵液中（助滤剂的用量，有一条经验规则可供参考，即助滤剂用 量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。）。 （2）填充-凝固剂 改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解性
二、 发酵液的过滤 微生物发酵液中含有大量菌体、细胞或细胞碎片以及残余的固体培养基成分。 过滤就是将悬浮在发酵液中的固体颗粒与液体进行分离的过程。 在过滤操作中，要求滤速快，滤液澄清并且有高的收率。 1，影响过滤速度的因素 过滤速度和以下因素有关 ①菌种； ②发酵条件（培养基的组成、未用完培养基的数量、消沫油、发酵周期、）。 （1）菌种对过滤速度影响 真菌的菌丝比较粗大，如青霉菌的菌丝直径可达 10ìm，发酵液容易过滤，不需 特殊处理。其滤渣呈紧密饼状物，很容易从滤布上刮下来，故可采用鼓式真空过滤 机过滤。 放线菌发酵液菌丝细而分枝，交织成网络状。如链霉素发酵液菌丝仅 0.5~1.0ìm 左右，还含有很多多糖类物质，粘性强，过滤较困难，一般需经预处理，以凝固蛋 白质等胶体。 细菌发酵液的菌体更细小，因此，过滤十分因准，如不用絮凝等方法预处理发 酵液，往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。 （2）培养基的组成对过滤速度影响 用黄豆粉、花生粉作氮源、淀粉作碳源会使过滤困难； 发酵后期加消泡油或剩余大量末用完的培养基也会使过滤困难。 （3）发酵周期对过滤的影响 正确选择发酵终了时间对过滤影响很大。在菌体丝自溶前必须放罐，因为细胞 自治后的 分解产物一股很难过滤。有时延长发酵周期虽能使发酵单位有所提高，但 严重影响发酵液质量，使色素和胶状杂质增多、过滤困难，最终造成成品质量降低。 2，改善过滤性能的方法 发酵工业中用于改善发酵液过滤性能的方法通常有：等电点、蛋白质变性、吸 附、凝聚和絮凝、加入助滤剂、直接在发酵液中形成填充-凝固剂、酶解作用。 （1）过滤助剂 助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。 过滤助剂可解决两个问题 ①滤饼的可压缩性问题 ②小粒子如菌丝碎片和细菌细胞，会渗入到转鼓真空过滤预覆盖层内部。使得 预覆盖层的部分孔被堵塞，影响了渗透性。加入助滤剂可以解决这一问题 常用的过滤助剂有：硅藻土、珍珠岩、磨碎的木浆、淀粉 助滤剂的加入有两种方法： ①在滤布上预先铺一层助滤剂(1~2mm)，该方法，会使滤速降低，但滤液透明 度 ②直接加入发酵液中（助滤剂的用量，有一条经验规则可供参考，即助滤剂用 量若等于悬浮液中固体含量时，滤速最快。）。 （2）填充-凝固剂 改善过滤性能较好的方法是加入一些反应剂，它们能相互作用，或和某些溶解性
盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4 等)。生成的沉淀能防止菌丝体粘结， 使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮物凝固， 如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙可作为填充-凝固剂。一方 面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和 磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、 镁离子。并且在发酵液中不会引入其它阳离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。正 确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高 3~10 倍。 （3）酶解作用 如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。 例如万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。 3，固-液分离设备的选择 不同性状约发酵液应选择不同的固-液分离设备。常用于发酵液的分离设备有： 板框压滤机、鼓式真空过滤机、离心沉降分离机 （1）板框压滤机 板框压滤机的过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能 耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适应性强，同时还具有结构简单， 价格低，动力消耗少等优点，因此，目前，国内广泛被采用。但是，这种设备不能 连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长(包括卸框、 卸饼、洗滤饼，洗滤布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。自动板框过滤 机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操 作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。对于菌体较细 小，粘度较大的发酵液，可加入助滤剂或采用絮凝等方法预处理后进行压滤。对于 难过滤的枯草杆菌发酵液，可设计一种特别薄的板框以减小滤饼的阻力。另外，也 可采用带有橡皮隔膜的压滤机，过滤结束时，在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来 压榨滤饼，将液体挤压出来。其优缺点概括如下： 优点： ①板框压滤机的过滤面积大； ②过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差； ③结构简单，价格低； ④动力消耗少等优点。 缺点 ①不能连续操作，设备笨重，劳动强度大； ②卫生条件差； ③非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。 （2）鼓式真空过滤机 鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较小，主要适用 于霉菌发酵液的过滤。例如，过滤青霉素发酵液的速度可达 800L/(m2 .h)。而对菌体 较细或粘稠的发酵液不太适用。一种较好的解决办法是过滤前在转鼓面上预铺一层 助滤剂，操作时，用一把缓慢向鼓面移动的刮刀将滤饼连同极薄的一层助滤剂一起 刮去，这样使过滤面积不断更新，以维持正常的过滤速度。放线菌发酵液可采用这 种方式过滤。其优缺点概括如下：
盐类发生反应生成不溶解的沉淀(CaSO4，AlPO4 等)。生成的沉淀能防止菌丝体粘结， 使菌丝具有块状结构，沉淀本身即可作为助滤剂，并且还能使胶状物和悬浮物凝固， 如新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷酸钠，生成的磷酸钙可作为填充-凝固剂。一方 面作为助滤剂，另一方面还可使某些蛋白质凝固。又如环丝氨酸发酵液用氧化钙和 磷酸处理，生成的磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固。多余的磷酸根离子，还能除去钙、 镁离子。并且在发酵液中不会引入其它阳离子而影环环丝氨酸的离子交换吸附。正 确选择反应剂和反应条件，能使过滤速度提高 3~10 倍。 （3）酶解作用 如发酵液中有不溶解的多糖存在则最好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速度。 例如万古霉素用淀粉作培养基，加入淀粉酶后，能使过滤速度加快。 3，固-液分离设备的选择 不同性状约发酵液应选择不同的固-液分离设备。常用于发酵液的分离设备有： 板框压滤机、鼓式真空过滤机、离心沉降分离机 （1）板框压滤机 板框压滤机的过滤面积大，过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能 耐受较高的压力差，故对不同过滤特性的发酵液适应性强，同时还具有结构简单， 价格低，动力消耗少等优点，因此，目前，国内广泛被采用。但是，这种设备不能 连续操作，设备笨重，劳动强度大，卫生条件差，非生产的辅助时间长(包括卸框、 卸饼、洗滤饼，洗滤布，重新压紧板框等)，阻碍了过滤效率的提高。自动板框过滤 机是一种较新型的压滤设备，它使板框的拆装，滤渣的脱落卸出和滤布的清洗等操 作都能自动进行，大大缩短了非生产的辅助时间和减轻了劳动强度。对于菌体较细 小，粘度较大的发酵液，可加入助滤剂或采用絮凝等方法预处理后进行压滤。对于 难过滤的枯草杆菌发酵液，可设计一种特别薄的板框以减小滤饼的阻力。另外，也 可采用带有橡皮隔膜的压滤机，过滤结束时，在滤板和橡皮膜之间通入压缩空气来 压榨滤饼，将液体挤压出来。其优缺点概括如下： 优点： ①板框压滤机的过滤面积大； ②过滤推动力(压力差)能较大幅度地进行调整，并能耐受较高的压力差； ③结构简单，价格低； ④动力消耗少等优点。 缺点 ①不能连续操作，设备笨重，劳动强度大； ②卫生条件差； ③非生产的辅助时间长，阻碍了过滤效率的提高。 （2）鼓式真空过滤机 鼓式真空过滤机能连续操作，并能实现自动化控制，但是压差较小，主要适用 于霉菌发酵液的过滤。例如，过滤青霉素发酵液的速度可达 800L/(m2 .h)。而对菌体 较细或粘稠的发酵液不太适用。一种较好的解决办法是过滤前在转鼓面上预铺一层 助滤剂，操作时，用一把缓慢向鼓面移动的刮刀将滤饼连同极薄的一层助滤剂一起 刮去，这样使过滤面积不断更新，以维持正常的过滤速度。放线菌发酵液可采用这 种方式过滤。其优缺点概括如下：
优点： ①能连续操作； ②能实现自动化控制 缺点： 压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。 （3）离心分离 ①优点： ②分离速度快，效率高； ③操作时卫生条件好等优点； ④适合于大规模的分离过程。 缺点： ①投资费用高，； ②能耗较大。 三、微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶， 霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化 酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步 纯化的出发原液，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转 入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 1，微生物细胞的破碎技术 常见的细胞破碎方法有：机械方法（球磨机、高压匀浆器、X-press 法、超声波 破碎）和非机械方法（酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法） （1）球磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快 速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样 品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 （2）高压匀浆器
优点： ①能连续操作； ②能实现自动化控制 缺点： 压差较小，主要适用于霉菌发酵液的过滤。 （3）离心分离 ①优点： ②分离速度快，效率高； ③操作时卫生条件好等优点； ④适合于大规模的分离过程。 缺点： ①投资费用高，； ②能耗较大。 三、微生物细胞的破碎 微生物的代谢产物有的分泌到细胞或组织之外，例如细菌产生的碱性蛋白酶， 霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。还有许多是存在于细胞内，例如青霉素酰化 酶，碱性磷酸酯酶等，称为胞内产物。 对于胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤，获得澄清的滤液，作为进一步 纯化的出发原液，对于胞内产物，则需首先收集菌体进行细胞破碎，使代谢产物转 入液相中，然后，再进行细胞碎片的分离。 1，微生物细胞的破碎技术 常见的细胞破碎方法有：机械方法（球磨机、高压匀浆器、X-press 法、超声波 破碎）和非机械方法（酶解法、渗透压冲击、冻结和融化、干燥法、化学法） （1）球磨机 研磨是常用的一种方法，它将细胞悬浮液与玻璃小珠、石英砂或氧化铝一起快 速搅拌或研磨，使达到细胞的某种程度破碎。这些装置的主要缺点是在破碎期间样 品温度迅速升高，通过用二氧化碳来冷却容器可得到部分解决。 （2）高压匀浆器
采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过 针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂 各种菌体一次通过高压匀浆器的破碎率 菌体 压力（Mpa） 破碎率（%） 面包酵母 啤酒酵母 大肠杆菌 解肢假丝酵母 53 55 53 55 62 61 67 43 （3）X-press 法 一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25˚C 至-30 ˚C 形成冰晶体， 利用 500 MPa 以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰 晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。 该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保 留率高，该法对冷冻—融解敏感的生化物质不适用。 （4）超声波法 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力， 由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发 生流动，从而使细胞破碎。 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏 阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却， 这是困难的。 （5）酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性强，发生酶解的条件温和。 缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。 溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的 α-1，4 糖苷键， 使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 （6）自溶作用 是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的 因素有温度、时间、pH 缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于 工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培 养液过滤速度也会降低。 （7）渗透压冲击 是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于 渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成 受抑制而强度减弱时才是合适的。 （8）冻结-融化法
采用高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用方法，利用高压迫使细胞悬浮液通过 针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环造成细胞破裂 各种菌体一次通过高压匀浆器的破碎率 菌体 压力（Mpa） 破碎率（%） 面包酵母 啤酒酵母 大肠杆菌 解肢假丝酵母 53 55 53 55 62 61 67 43 （3）X-press 法 一种改进的高压方法是将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25˚C 至-30 ˚C 形成冰晶体， 利用 500 MPa 以上的高压冲击，冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰 晶体的磨损，包埋在冰中的微生物的变形所引起的。 该法的优点是适用的范围广，破碎率高，细胞碎片的粉碎程度低以及活性的保 留率高，该法对冷冻—融解敏感的生化物质不适用。 （4）超声波法 细胞的破碎是由于超声波的空穴作用，从而产生一个极为强烈的冲击波压力， 由它引起的粘滞性旋涡在介质中的悬浮细胞上造成了剪切应力，促使细胞内液体发 生流动，从而使细胞破碎。 对于不同菌种的发酵液、超声波处理的效果不同，杆菌比球菌易破碎、革兰氏 阴性菌细胞比革兰氏阳性菌细胞容易破碎，对酵母菌的效果级差。 该法不适于大规模操作，因为放大后，要输入很高的能量来提供必要的冷却， 这是困难的。 （5）酶解法 利用酶反应，分解破坏细胞壁上特殊的键，从而达到破壁的目的。 优点：专一性强，发生酶解的条件温和。 缺点：酶水解费用较贵，一般只适用于小规模的实验室研究。 溶菌酶是应用最多的酶，它能专一地分解细胞壁上糖蛋白分子的 α-1，4 糖苷键， 使脂多糖解离，经溶菌酶处理后的细胞移至低渗溶液中使细胞破裂。 （6）自溶作用 是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。影响自溶过程的 因素有温度、时间、pH 缓冲液浓度、细胞代谢途径等。自溶法在一定程度上能用于 工业规模，但是，对不稳定的微生物容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培 养液过滤速度也会降低。 （7）渗透压冲击 是较温和的一种破碎方法，将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或 蔗糖溶液)，入达到平衡后，介质被突然稀释，或者将细胞转入水或缓冲液中，由于 渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞壁的破裂。 渗透压冲击的方法仅对细胞壁较脆弱的菌，或者细胞壁预先用酶处理，或合成 受抑制而强度减弱时才是合适的。 （8）冻结-融化法
将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷 冻，一方面能使细胞膜的硫水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面 胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较 脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。 另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。 （9）干燥法 可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵 母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法 条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。 （10）化学法 用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞 内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿 素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问 题。 2，破碎方法的选择 选择合适的破碎方法需要考虑下列因素： （1）细胞的数量； （2）所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性； （3）要达到的破碎程度及破碎所必要的速度， （4）尽可能采用最温和的方法； （5）具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术
将细胞放在低温下突然冷冻和室温下融化，反复多次而达到破壁作用。由于冷 冻，一方面能使细胞膜的硫水键结构破裂，从而增加了细胞的亲水性能，另一方面 胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞突然膨胀而破裂。对于细胞壁较 脆弱的菌体，可采用此法。但通常破碎率很低即使反复循环多次也不能提高收率。 另外，还可能引起对冻融敏感的某些蛋白质的变性。 （9）干燥法 可采用空气干燥，真空干燥，喷雾干燥和冷冻干燥等。空气干燥主要适用于酵 母菌。真空干燥适用于细菌的干燥。冷冻干燥适用于较不稳定的生化物质。干燥法 条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。 （10）化学法 用酸碱及表面活性剂处理，可以使蛋白质水解，细胞溶解或使某些组分从细胞 内渗漏出来。某些脂溶性溶剂也能作为化学处理的方法，如丁醇、丙酮、氯仿及尿 素等。但是，这些试剂容易引起生化物质破坏，还会带来分离和回收化学物质的问 题。 2，破碎方法的选择 选择合适的破碎方法需要考虑下列因素： （1）细胞的数量； （2）所需要的产物对破碎条件(温度、化学试剂、酶等)的敏感性； （3）要达到的破碎程度及破碎所必要的速度， （4）尽可能采用最温和的方法； （5）具有大规模应用潜力的生化产品应选择适合于放大的破碎技术