实验三发酵菌株的初筛一、实验目的从自然界中筛选一株能够合成淀粉酶或蛋白酶的菌株，学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的筛选方法。二、实验原理淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可以根据淀粉培养基上透明圈的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。蛋白酶也是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根据透明圈大小还能判断产酶活力。三、实验材料及试剂1.实验材料A.淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白陈10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g琼脂20g，蒸馏水1000mL。B.蛋白酶产生菌筛选培养基：葡萄糖0.5g，氯化钠5g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，酪蛋白10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。C.碘液、2.5%三氯乙酸溶液2.实验器材：培养皿、吸管、250ml三角瓶、无菌水（含灭菌玻璃珠）、标签纸、玻璃刮铲、吸管、电炉、天平等。四、实验方法与步骤1.碘液的配置称取KI2.0g，用50mL去纯水溶解KI，迅速称量Iz0.5g并加入KI溶液中，用纯水定容到100ml，搅拌溶解后保存在棕色瓶中，橡皮塞封口。2配制淀粉酶或蛋白酶的筛选培养基，分别装于三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却至60℃时倒平板，每皿约20mL。3.土样的采集8
8 实验三 发酵菌株的初筛 一、 实验目的 从自然界中筛选一株能够合成淀粉酶或蛋白酶的菌株，学习淀粉酶、蛋白酶产生菌的 筛选方法。 二、 实验原理 淀粉酶是一类淀粉水解酶的统称，它能将淀粉水解成糊精等小分子物质并进一步水解 成麦芽糖或葡萄糖，淀粉被水解后，遇碘不再变蓝色，因此可以根据淀粉培养基上透明圈 的大小来判断所选菌株的淀粉酶活力。 蛋白酶也是一类重要的工业用酶制剂，它能将蛋白质分解成短肽甚至氨基酸。根据三 氯乙酸能将酪蛋白变性从而产生沉淀这一原理，可在平板培养基上直接筛选蛋白酶产生菌 株。产酶菌株能将酪蛋白水解成小分子物质，菌落周围不形成沉淀蛋白而出现透明圈，根 据透明圈大小还能判断产酶活力。 三、 实验材料及试剂 1. 实验材料 A. 淀粉酶产生菌筛选培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，氯化钠 5g，可溶性淀粉 2g， 琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。 B. 蛋白酶产生菌筛选培养基：葡萄糖 0.5g，氯化钠 5g，磷酸氢二钾 0.5g，磷酸二 氢钾 0.5g，酪蛋白 10g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。 C. 碘液、2.5%三氯乙酸溶液 2. 实验器材：培养皿、吸管、250ml 三角瓶、无菌水（含灭菌玻璃珠）、标签纸、玻璃 刮铲、吸管、电炉、天平等。 四、 实验方法与步骤 1. 碘液的配置 称取 KI2.0g，用 50mL 去纯水溶解 KI，迅速称量 I2 0.5g 并加入 KI 溶液中，用纯水定 容到 100ml，搅拌溶解后保存在棕色瓶中，橡皮塞封口。 2. 配制淀粉酶或蛋白酶的筛选培养基，分别装于三角瓶中，121℃灭菌 30 分钟，冷却至 60℃时倒平板，每皿约 20mL。 3. 土样的采集
每组分别不同环境的土样并记录当时取样环境情况，以小组为单位进行稀释分离。取土样1g，加入9mL无菌水，逐步稀释至10°、10°、10°，分别在两种筛选培养基上进行涂布，每个梯度涂2个培养皿。然后置于30℃恒温培养48h。4.产淀粉酶菌株的鉴定。挑选淀粉酶筛选培养皿上的单菌落接种到新的无菌培养Ⅲ上，同时用签字笔对各单菌落在底皿标号。标记接种过的培养皿30℃培养24h，取其中一Ⅲ在平板上滴加碘液，以铺满平皿为度，如果菌落周围有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产淀粉酶，透明圈与菌落直径之比越大，说明产淀粉酶活力越强。5.产蛋白酶菌株的鉴定蛋白酶菌株的鉴定方法同上，蛋白酶产生菌培养基上形成菌落后，可在平板上滴加2.5%三氯乙酸溶液，以刚铺满平Ⅲ为度，菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌产蛋白酶。比透明圈=透明圈直径（mm）／菌落直径（mm）6.菌种保藏每组将活性优良的菌株接入斜面试管保存，待下一次用。五、记录与结果1.环境情况地点一：地点二：地点三：2.绘制出透明圈地点一地点二地点三产酶菌落数比透明圈六、结果分析9
9 每组分别不同环境的土样并记录当时取样环境情况，以小组为单位进行稀释分离。取 土样 1g，加入 9mL 无菌水，逐步稀释至 105、106、107，分别在两种筛选培养基上进行涂布， 每个梯度涂 2 个培养皿。然后置于 30℃恒温培养 48h。 4. 产淀粉酶菌株的鉴定。 挑选淀粉酶筛选培养皿上的单菌落接种到新的无菌培养皿上，同时用签字笔对各单菌 落在底皿标号。标记接种过的培养皿 30℃培养 24h，取其中一皿在平板上滴加碘液，以铺 满平皿为度，如果菌落周围有透明圈出现，说明淀粉被水解，该菌能产淀粉酶，透明圈与 菌落直径之比越大，说明产淀粉酶活力越强。 5. 产蛋白酶菌株的鉴定 蛋白酶菌株的鉴定方法同上，蛋白酶产生菌培养基上形成菌落后，可在平板上滴加 2.5%三氯乙酸溶液，以刚铺满平皿为度，菌落周围如有无色透明圈出现，说明该菌产蛋白 酶。 比透明圈＝透明圈直径（mm）/ 菌落直径（mm） 6. 菌种保藏 每组将活性优良的菌株接入斜面试管保存，待下一次用。 五、 记录与结果 1. 环境情况 地点一： 地点二： 地点三： 2. 绘制出透明圈 地点一 地点二 地点三 产酶菌 落数 比透 明圈 六、 结果分析
从不同地点获得的结果进行分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。七、作业1.为什么要用淀粉作为碳源？2.在观察结果的过程中为什么要及时观察，否则会有什么的后果。3.为什么同样一个同样要稀释几个不同梯度进行涂平板。10
10 从不同地点获得的结果进行分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结 论。 七、 作业 1. 为什么要用淀粉作为碳源？ 2. 在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果。 3. 为什么同样一个同样要稀释几个不同梯度进行涂平板
实验四土中产醋酸菌种的分离筛选一、实验目的从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株，加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。二、实验原理分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富集技术。同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。产醋酸菌种在含有一定量碳酸钙的牛肉育蛋白陈固体培养基中培养后，形成混浊半透明状态。根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小以及滴定结果，判断产醋酸能力的大小。三、实验材料及试剂1．牛肉育蛋白陈培养基：牛肉育3.0克，蛋白陈10.0克，氯化钠5.0克，琼脂20克，蒸馏水1000mL，pH7.2~7.4。2．产醋酸菌分离培养基：牛肉膏蛋白陈培养基灭菌后，加入5%无菌碳酸钙和0.03%无水乙醇。3.0.1moL/LNaOH、5%三氯化铁溶液（质量比）、碳酸钙。4.土样浸出汁制备：称取5g在105～115℃下烘干的土壤样品，放入50mL干燥的锥形瓶中，加入25mL0.5mo1/L的碳酸氢钠浸提。用玻璃棒把土壤搅散。再加入半药匙活性炭，剧烈振荡1～2min后静置510min，过滤后得到土壤浸出液。四、仪器设备全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管、试管、小铲、天平、涂布棒、酒精灯五、实验步骤1.采样：选取离地面5～15cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。2.增殖：称取0.5g土样（湿重），加到含10mL无菌土样浸出汁的试管中，于26℃条件下培养25min。11
11 实验四 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 一、 实验目的 从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株，加深对发酵工程上游技术中菌种选育 的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二、 实验原理 分离土样中的大部分细菌的分离程序中无需进行富集，但对某些少数细菌则要求特殊 的富集或选择技术才能很好地被分离培养。运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若 干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细菌某一特殊基因组，可以建立若干富 集技术。同样，富集可以促进抗性的产生并维持下来。 产醋酸菌种在含有一定量碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中培养后，形成混浊半透 明状态。根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小以及滴定结果，判断产醋酸能力的大小。 三、 实验材料及试剂 1. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 3.0 克，蛋白胨 10.0 克，氯化钠 5.0 克，琼脂 20 克， 蒸馏水 1000mL，pH7.2～7.4。 2. 产醋酸菌分离培养基：牛肉膏蛋白胨培养基灭菌后，加入 5%无菌碳酸钙和 0.03%无水 乙醇。 3. 0.1moL/LNaOH、5%三氯化铁溶液（质量比）、碳酸钙。 4. 土样浸出汁制备：称取 5g 在 105～115℃下烘干的土壤样品，放入 50mL 干燥的锥形瓶 中，加入 25mL 0.5mol/L 的碳酸氢钠浸提。用玻璃棒把土壤搅散。再加入半药匙活性 炭，剧烈振荡 1～2min 后静置 5～10min，过滤后得到土壤浸出液。 四、 仪器设备 全自动高压灭菌锅，培养箱，酸式滴定管、试管、小铲、天平、涂布棒、酒精灯 五、 实验步骤 1. 采样：选取离地面 5～15 cm 处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或 玻璃瓶中。 2. 增殖：称取 0.5g 土样（湿重），加到含 10mL 无菌土样浸出汁的试管中，于 26℃条件 下培养 25min
3.增菌液的稀释：用一支1mL无菌吸管吸取1mL制备好的增菌液，注入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，振摇制成10-增菌液，按照10倍递增稀释分离法进一步制成10-2、10-、10、10°、10增菌液，注意每递增稀释一次即换用一支1mL吸管。4.吸取稀释液：根据样品情况，选取10、10°、10°三个稀释度培养液，分别吸取0.1mL涂布于土浸出汁平板，每个稀释度做三个平行。待样液吸收后倒置平皿于26℃下培养4～10天，将长出的菌落接入斜面。5.分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。6.初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉音蛋白陈固体培养基中进行培养，如果细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初步筛选出产酸高的菌种。7.复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白陈液体培养基中37℃深层培养24h后。取出培养液5m1加入试管内，加0.1moL/LNa0H液中和至pH为7.0，然后加5%氯化铁液2～3滴，摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无红褐色沉淀生出，根据所消耗的NaOH量确定产物醋酸的具体生成量。六、实验结果菌株23451CNaOH的消耗量（ml）醋酸的生成量（m1）反应液颜色变化七、思考题1.如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？12
12 3. 增菌液的稀释：用一支 1mL 无菌吸管吸取 1mL 制备好的增菌液，注入盛有 9mL 无菌生 理盐水的试管中，振摇制成 10-1 增菌液，按照 10 倍递增稀释分离法进一步制成 10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6 增菌液，注意每递增稀释一次即换用一支 1mL 吸管。 4. 吸取稀释液：根据样品情况，选取 10-4、10-5、10-6 三个稀释度培养液，分别吸取 0.1 mL 涂布于土浸出汁平板，每个稀释度做三个平行。待样液吸收后倒置平皿于 26℃下培 养 4～10 天，将长出的菌落接入斜面。 5. 分离：利用产物特性分离得到产目标产物的纯种。 6. 初筛：将细菌接种到含有一定的碳酸钙的牛肉膏蛋白胨固体培养基中进行培养，如果 细菌产酸则培养基出现混浊半透明状态，可以根据菌体产生酸溶解出现透明圈大小初 步筛选出产酸高的菌种。 7. 复筛：将初筛菌种在斜面培养纯化后，接到牛肉膏蛋白胨液体培养基中 37℃深层培养 24h 后。取出培养液 5m1 加入试管内，加 0.1moL/LNaOH 液中和至 pH 为 7.0，然后加 5% 氯化铁液 2～3 滴，摇匀，观察液色是否变为黄红色，如将试管放在火焰上煮沸，有无 红褐色沉淀生出，根据所消耗的 NaOH 量确定产物醋酸的具体生成量。 六、 实验结果 菌 株 1 2 3 4 5 6 NaOH 的消耗量（ml） 醋酸的生成量（ml） 反应液颜色变化 七、 思考题 1. 如果培养中有其它种挥发酸共存，应采用什么方法来测定醋酸的生成量？