生物技术制药实验2018
生物技术制药实验 2018
目录第一篇基因工程制药综合实验实验一SIX1基因的PCR扩增反应实验二水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA11实验三DNA的重组连接14实验四重组质粒的转化18实验五转化子DNA的快速提取22实验六重组转化子的PCR鉴定24第二篇细胞工程制药综合实验26实验一细胞培养26实验二PEI转染动物细胞28实验三动物细胞蛋白的提取方法.31实验四蛋白浓度测定方法32实验五SDS-PAGE电泳33实验六WESTERNBLOT检测35第三篇酶工程制药综合实验41高产淀粉酶菌株的筛选41V
V 目 录 第一篇 基因工程制药综合实验. 7 实验一 基因的 PCR 扩增反应. 8 实验二 水平式琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA. 11 实验三 DNA 的重组连接. 14 实验四 重组质粒的转化 . 18 实验五 转化子 DNA 的快速提取. 22 实验六 重组转化子的 PCR 鉴定. 24 第二篇 细胞工程制药综合实验. 26 实验一 细胞培养. 26 实验二 PEI 转染动物细胞 . 28 实验三 动物细胞蛋白的提取方法 . 31 实验四 蛋白浓度测定方法. 32 实验五 SDS-PAGE 电泳. 33 实验六 WESTERN BLOT 检测 . 35 第三篇 酶工程制药综合实验. 41 高产淀粉酶菌株的筛选 . 41
第四篇沙棘粗多糖的提取、纯化及鉴定45第五篇免疫组织化学检测48第六篇发酵罐说明及使用.51实验一气升式生化反应器的应用51实验二中试发酵设备的使用方法53附录发酵罐的简介....56VI
VI 第四篇 沙棘粗多糖的提取、纯化及鉴定. 45 第五篇 免疫组织化学检测. 48 第六篇 发酵罐说明及使用. 51 实验一 气升式生化反应器的应用 . 51 实验二 中试发酵设备的使用方法 . 53 附录 发酵罐的简介. 56
第一篇基因工程制药综合实验SIX1重组质粒的构建及蛋白表达质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。大部分的质粒都是环状构型，然而目前也发现少数的线性质粒；天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒的拷贝数（copynumber）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。近几十年来，由于分子生物学的发展，人们利用质粒融合技术的频率越来越高，作为一种成熟的分子生物学实验技术，构建质粒成为一种越来越普及的基础而重要的方法。质粒构建技术是基因工程常用的技术之一，即是将一段需要的外源DNA（特异片段或全长片段）插入到载体质粒中形成重组DNA，然后将该重组DNA转运到宿主细胞中。常规的质粒构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，即双酶切后可以产生相同的粘性未端。当前还有In-Fusion融合方法，此方法的先进之处在于连接时间从常规方法的16～18hr缩短到15min，大大缩短了试验时间，提高了实验效率。Six1作为一个重要的调控基因，其表达产物参与肿瘤细胞的迁移和扩散，研究者发现，SIX1过表达的现象在多种癌细胞中表现，如在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等一些女性癌症中表现出Six1过表达。同时SIX1和EYA结合也表现出介导癌细胞迁移的功能，靶向SIX1或SIX1-EYA将可能成为一个有前景的癌症治疗目标。本实验以构建表达Six1蛋白基因工程菌为目的，通过PCR技术、酶切、链接等方法获取重组质粒，再用Westernblot法检测SIXl目的蛋白，以此确定SIX1目的蛋白被正确表达，本实验以DH5α大肠杆菌为宿主构建重组子，鉴定成功后提取质粒并转化BL21，构建含有BL21-pET28a-SIX1基因工程菌，经过菌落PCR等方法进行验证。7
7 第一篇 基因工程制药综合实验 SIX1 重组质粒的构建及蛋白表达 质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区 DNA 原有的能够自主复制的 较小的 DNA 分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中， 乃至于植物的线粒体等细胞器中。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以 同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。大部分的质粒都是环状构型，然而目前也发现少数 的线性质粒；天然质粒的 DNA 长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒的拷贝数（copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中 就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能 力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有 决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。 近几十年来,由于分子生物学的发展,人们利用质粒融合技术的频率越来越高，作为一种 成熟的分子生物学实验技术，构建质粒成为一种越来越普及的基础而重要的方法。 质粒构建技术是基因工程常用的技术之一，即是将一段需要的外源 DNA（特异片段或全 长片段）插入到载体质粒中形成重组 DNA，然后将该重组 DNA 转运到宿主细胞中。常规的 质粒构建方法是在插入片段和载体两端分别寻找相同的酶切位点，即双酶切后可以产生相同 的粘性末端。当前还有 In-Fusion 融合方法，此方法的先进之处在于连接时间从常规方法的 16～18hr 缩短到 15min，大大缩短了试验时间，提高了实验效率。 Six1 作为一个重要的调控基因，其表达产物参与肿瘤细胞的迁移和扩散，研究者发现， SIX1 过表达的现象在多种癌细胞中表现，如在乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌等一些女性癌症中表 现出 Six1 过表达。同时 SIX1 和 EYA 结合也表现出介导癌细胞迁移的功能，靶向 SIX1 或 SIX1-EYA 将可能成为一个有前景的癌症治疗目标。本实验以构建表达 Six1 蛋白基因工程菌 为目的，通过 PCR 技术、酶切、链接等方法获取重组质粒，再用 Western blot 法检测 SIX1 目的蛋白，以此确定 SIX1 目的蛋白被正确表达， 本实验以 DH5α 大肠杆菌为宿主构建重组子，鉴定成功后提取质粒并转化 BL21，构建含 有 BL21-pET28a-SIX1 基因工程菌，经过菌落 PCR 等方法进行验证
实验一SIX1基因的PCR扩增反应一、实验目的1.学习PCR反应的基本原理与实验技术。2.了解引物设计的一般要求。二、实验原理单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA多聚酶按5'→3方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。扩增后的双链DNA分子经高温变性后文成为两条单链DNA，它们都可作为模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出各自互补的产物DNA。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA5端的引物(P1)对应于上链DNA单链的序列，3°端的引物（P2)对应于下链DNA单链的序列，P1和P2按5'→3方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP4种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，然后在一中间温度作用下，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2"方式扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量足够，扩增过程无限重复，便可使模板DNA无限扩增。PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩增后增加到百万倍以上，因此用微量的DNA样品不仅可获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆。目前，PCR技术已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦也具有极大的应用价值。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25～35，变性温度为94℃。复性温度为37C～55℃（具体反应温度应根据引物的Tm值而决定），合成延伸温度为72℃，DNA聚台酶为Tag酶（可耐受95℃左右的高温而不失活)，DNA扩增倍数为1010%。引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25个核苷酸；②CG含量为40%～60%；③TM值高于55℃[TM=4(C十G)十2(A十T)计算]：④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；③两条引物间配对碱基数小于5个；③避免引物内部形成二级结构，若引物自身配对（特别是在引物的3端形成茎环结构），茎的碱基对数不大于3。8
8 实验一 SIX1 基因的 PCR 扩增反应 一、实验目的 1．学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。 2．了解引物设计的一般要求。 二、实验原理 单链 DNA 在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用 DNA 多聚酶按 5’→3’方向复制出 互补 DNA。这时单链 DNA 称为模板 DNA，寡聚核苷酸片段称为引物(Primer)，合成的互补 DNA 称为产物 DNA。扩增后的双链 DNA 分子经高温变性后又成为两条单链 DNA，它们都 可作为模板 DNA，在相应的引物引导下，用 DNA 聚合酶复制出各自互补的产物 DNA。PCR 反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列 DNA 分子两端各设计一条引物，其中 在 DNA 5’端的引物(P1)对应于上链 DNA 单链的序列，3’端的引物(P2)对应于下链 DNA 单链 的序列，P1 和 P2 按 5’→3’方向相向配置。在含有引物、DNA 合成底物 dNTPs (dATP、dCTP、 dGTP、dTTP4 种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物)的缓冲液中，通过高温变性，使双链 DNA 变成单链 DNA 模板，降低温度复性，使引物与模板 DNA 配对，然后在一中间温度作用下， 利用 DNA 聚合酶便可合成产物 DNA。引物和 dNTPs 过量，则在同一反应体系中可重复高温 变性、低温复性和 DNA 合成这—循环，使产物 DNA 重复合成，并且在重复过程中，前一循 环的产物 DNA 可作为后一循环的模板 DNA 参与 DNA 的合成，使产物 DNA 的量按 2 n方式 扩增，所以这一反应称为链式扩增反应。理论上如果引物及 dNTP 的量足够，扩增过程无限 重复，便可使模板 DNA 无限扩增。PCR 反应使几个 DNA 模板分子通过数小时扩增后增加到 百万倍以上，因此用微量的 DNA 样品不仅可获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克 隆。目前，PCR 技术已成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究 和医疗诊断中亦也具有极大的应用价值。 常规 PCR 反应用于已知 DNA 序列的扩增，反应循环数为 25～35，变性温度为 94℃。复 性温度为 37C～55℃（具体反应温度应根据引物的 Tm 值而决定），合成延伸温度为 72℃， DNA 聚台酶为 Taq 酶(可耐受 95℃左右的高温而不失活)，DNA 扩增倍数为 106～109。 引物的设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15～25 个核苷酸；②CG 含量 为 40％～60％；③TM 值高于 55℃ [TM＝4(C 十 G)十 2(A 十 T)计算]；④引物与模板非特异 性配对位点的碱基配对率小于 70％；⑤两条引物间配对碱基数小于 5 个；⑥避免引物内部形 成二级结构，若引物自身配对(特别是在引物的 3’端形成茎环结构)，茎的碱基对数不大于 3