发酵工程实验指导书二O一八
发酵工程实验指导书 二〇一八
目录基础实验实验一酵母菌的分离和纯化实验二乳酸菌的分离和鉴别4实验三发酵菌株的初筛8实验四土壤中产醋酸菌种的分离筛选11实验五枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育..13实验六枯草芽孢杆菌生长曲线的测定16实验七发酵培养基营养条件的优化18实验八发酵罐的构造及空消..20实验九淀粉的液化及糖化..25实验十.29总糖和还原糖的测定--DNS法实验十一固定化酵母酒精发酵32综合实验综合实验一糯米甜酒的制备35综合实验二酸乳的制作. 38综合实验三葡萄酒的酿造44综合实验四啤酒发酵50实验一协定法糖化试验. 51实验二.54啤酒酵母纯种分离.实验三啤酒酵母的计数56实验四啤酒酵母的质量检查58
目 录 基础实验 实验一 酵母菌的分离和纯化. 1 实验二 乳酸菌的分离和鉴别. 4 实验三 发酵菌株的初筛 . 8 实验四 土壤中产醋酸菌种的分离筛选 . 11 实验五 枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育. 13 实验六 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定 . 16 实验七 发酵培养基营养条件的优化 . 18 实验八 发酵罐的构造及空消. 20 实验九 淀粉的液化及糖化. 25 实验十 总糖和还原糖的测定──DNS 法 . 29 实验十一 固定化酵母酒精发酵. 32 综合实验 综合实验一 糯米甜酒的制备. 35 综合实验二 酸乳的制作 . 38 综合实验三 葡萄酒的酿造. 44 综合实验四 啤酒发酵 . 50 实验一 协定法糖化试验 . 51 实验二 啤酒酵母纯种分离. 54 实验三 啤酒酵母的计数 . 56 实验四 啤酒酵母的质量检查. 58
实验五啤酒酵母的扩大培养61实验六62麦芽汁的制备实验七糖度的测定65实验八啤酒主发酵.69实验九总还原糖含量的测定（斐林试剂法）.71实验十【-氨基氮含量的测定73a实验十一酸度和pH的测定.75实验十二比重的测定.77实验十三.80酒精度的测定及原麦汁浓度的计算实验十四双乙酰含量的测定84实验十五色度的测定.86实验十六苦味质的测定.88实验十七.89二氧化碳含量的测定实验十八90后发酵91实验十九啤酒质量品评
实验五 啤酒酵母的扩大培养. 61 实验六 麦芽汁的制备 . 62 实验七 糖度的测定 . 65 实验八 啤酒主发酵 . 69 实验九 总还原糖含量的测定（斐林试剂法）. 71 实验十 α –氨基氮含量的测定. 73 实验十一 酸度和 pH 的测定. 75 实验十二 比重的测定 . 77 实验十三 酒精度的测定及原麦汁浓度的计算. 80 实验十四 双乙酰含量的测定. 84 实验十五 色度的测定 . 86 实验十六 苦味质的测定 . 88 实验十七 二氧化碳含量的测定. 89 实验十八 后发酵. 90 实验十九 啤酒质量品评 . 91
实验一酵母菌的分离和纯化实验目的一、应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。二、实验原理大多数酵母菌为腐生，其生长最适pH为4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。三、实验材料及试剂1.成熟葡萄或苹果等果皮。2．马铃薯葡萄糖琼脂培养基：原料：马铃薯（200g）、葡萄糖（20g）、琼脂（20g）、蒸馏水（1000ml），分装三角瓶。配制方法：（1）先将马铃薯去皮，切片，称200g并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。(2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。（3）在120℃条件下高压灭菌20分种。3.乳酸马铃薯葡萄糖培养液：原料：马铃薯（200g）、葡萄糖（20g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水（1000mL），分装三角瓶。4.0.1%美蓝染液：0.1g美蓝溶于100mL蒸馏水中。5.生理盐水四、主要仪器设备1
1 实验一 酵母菌的分离和纯化 一、 实验目的 应用酵母的生理生化和生态学特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯 化的基本方法。 二、 实验原理 大多数酵母菌为腐生，其生长最适 pH为 4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如 果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中， 酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点（酸性条件则可以抑制细菌的生长），常用酸性液体 培养基获得酵母菌的培养液，然后在固体培养基上用划线法分离纯化。 三、 实验材料及试剂 1. 成熟葡萄或苹果等果皮。 2. 马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、琼脂（20 g）、蒸馏水（1000ml），分装 三角瓶。配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称 200 g 并加蒸馏水 1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤， 补足蒸馏水量至 1000ml，制成 20%的马铃薯汁。 （2）在 20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，加入葡萄糖，搅拌均匀，制成的马铃 薯葡萄糖琼脂培养基，补足水分。 （3）在 120℃条件下高压灭菌 20 分种。 3. 乳酸马铃薯葡萄糖培养液： 原料：马铃薯（200 g）、葡萄糖（20 g）、乳酸（5mL）、pH5.5、蒸馏水 （1000mL），分装三角瓶。 4. 0.1%美蓝染液：0.1g 美蓝溶于 100mL 蒸馏水中。 5. 生理盐水 四、 主要仪器设备
高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1m1的无菌吸管、18*180mm试管、培养血、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。五、实验方法1.接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装100mL无菌生理盐水的三角瓶中，充分搅拌后，用无菌移液管吸取1mL接入到9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置28～30℃，培养24小时。（每组转接3支试管）2．加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液1mL，注入另一管9mL乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28～30℃再培养24h。3.镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的0.1%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原，菌体不着色。4.涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取0.1mL加富培养液到平板中，涂匀后28～30℃培养24h。5.分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。6.镜检：挑取单菌落，制片观察形态。7.挑取单个纯菌落，每组转接3支斜面试管，备用。六、实验结果的观察及记录时间试管1试管2试管3观察并记录第一次接种后观察试管内培养液的情况+观察试管内培养液的情况镜检培养液内菌的形态结构2加富培养后粗略判断是否为酵母菌3分离纯化后观察培养皿内菌落形态七、实验注意事项2
2 高压蒸汽灭菌器、天平、恒温培养箱、显微镜、酒精灯、电炉、1ml 的无菌吸管、 18*180mm 试管、培养皿、接种针、载玻片、盖玻片、牛皮纸（报纸）、绳线、菜刀、案板、 纱布、烧杯、玻璃棒、超净工作台等。 五、 实验方法 1. 接种：取一小块果皮（不需冲洗），加入到盛装 100mL 无菌生理盐水的三角瓶中，充 分搅拌后，用无菌移液管吸取 1mL 接入到 9mL 乳酸马铃薯葡萄糖培养液试管中，置 28～30℃，培养 24 小时。（每组转接 3 支试管） 2. 加富培养：用无菌移液管吸取上述培养后培养液 1mL，注入另一管 9mL 乳酸马铃薯葡 萄糖培养液中，置 28～30℃再培养 24h。 3. 镜检观察：用无菌操作法用接种环取少许菌液置于载玻片中央的 0.l%美蓝染色液中， 混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情 况。并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因为活细胞使美兰染液还原， 菌体不着色。 4. 涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌移液管吸取 0.1mL 加富培 养液到平板中，涂匀后 28～30℃培养 24h。 5. 分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上划线，培养后分离得到单个菌落。 6. 镜检：挑取单菌落，制片观察形态。 7. 挑取单个纯菌落，每组转接 3 支斜面试管，备用。 六、 实验结果的观察及记录 时间 观察并记录 试管1 试管2 试管3 1 第一次接种后 观察试管内培养液的情况 2 加富培养后 观察试管内培养液的情况 镜检培养液内菌的形态结构 粗略判断是否为酵母菌 3 分离纯化后 观察培养皿内菌落形态 七、 实验注意事项