1.配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸，2.灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。3.接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。3
3 1. 配制培养基时，对培养基加热时应注意不断搅拌，防止琼脂的糊底与暴沸。 2. 灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开 人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能 开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。 3. 接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒
实验二乳酸菌的分离和鉴别实验目的一、了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。二、实验原理乳酸细菌科属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。微需氧、厌氧或兼性厌氧，在BCG牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状：乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。含乳酸菌的样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。较简便的活力测定包括凝乳时间、产酸和活菌数量等指标的检测。三、实验材料及试剂1.实验材料：市售含活乳酸菌的酸奶。2.1BCG牛乳培养基：（A）溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。（B）溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g，pH6.8（用1mo1/LNa0H或1mo1/LHC）调pH），121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将（A）、（B）溶液混合均匀后倒平板。3.生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。4.脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或者脱脂乳粉与5%熊糖水按照1：10的比例配制，装量以试管的1/3为宜，121℃灭菌15min。5.革兰氏染色液、香柏油、二甲苯6.0.1mo1/L氢氧化钠标准溶液7.1%酚酞指示剂：1g酚溶于95%酒精，定容至100mL四、仪器设备4
4 实验二 乳酸菌的分离和鉴别 一、 实验目的 了解和掌握乳酸菌的菌种特性；初步掌握乳酸菌分离的一般方法。 二、 实验原理 乳酸细菌科属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科，根据细胞呈球状或呈杆状，又分 成乳酸杆菌族和链球菌族。微需氧、厌氧或兼性厌氧，在 BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳 酸菌菌落大约 1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。乳酸 菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。 乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长 丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。 含乳酸菌的样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液 接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌 落代表原样品中的一个单细胞。较简便的活力测定包括凝乳时间、产酸和活菌数量等指标 的检测。 三、 实验材料及试剂 1. 实验材料：市售含活乳酸菌的酸奶。 2. BCG 牛乳培养基： （A）溶液：脱脂乳粉 100g，水 500mL，加入 1.6%溴甲酚绿（BCG）乙醇溶液 1mL，80℃ 灭菌 20min。 （B）溶液：酵母膏 10g，水 500mL，琼脂 20g，pH 6.8（用 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl 调 pH），121℃湿热灭菌 20min。以无菌操作趁热将（A)、（B）溶液混合均匀后倒平 板。 3. 生理盐水：称取 9g 氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到 1000 毫升。 4. 脱脂乳试管：直接选用脱脂乳液或者脱脂乳粉与 5%蔗糖水按照 1:10 的比例配制，装 量以试管的 1/3 为宜，121℃灭菌 15min。 5. 革兰氏染色液、香柏油、二甲苯 6. 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液 7. 1%酚酞指示剂 ：1g 酚酞溶于 95%酒精，定容至 100mL 四、 仪器设备
超净工作台、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜、显微镜、碱式滴定仪、天平、培养皿、1mL和10mL移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接种针、涂布器、载玻片、涂布棒、250mL三角瓶、滤纸条等。五、实验方法与步骤（一）乳酸菌的分离1．菌悬液的配制：取一洁净三角瓶，盛以225mL生理盐水；6支洁净试管，各盛9mL的生理盐水；加塞包扎于121℃高压蒸汽灭菌20min，得到无菌生理盐水。2.将酸奶样品搅拌均匀，用10mL无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌生理盐水的三角瓶中，充分振摇，使样品均匀分散，即为1：10的均匀稀释液；3．将6支装9mL生理盐水的无菌试管，依次标记10°、10、10、10、10°、10°，取1mL无菌移液管吸1:10的菌悬液沿管壁徐徐注入装有9mL灭菌生理盐水的试管中，稀释混匀便得到1：100稀释液，按上述操作顺序，制10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用1支1mL吸管。根据样品情况，制得10～10的稀释液。4.倒平板：取无菌平皿9个，编号标明10″、10°、10各三套；按无菌操作将经高温消毒冷却到50℃左右的培养基注入9个平血，每皿约15mL；转动平皿，使培养基均匀分布在皿底，待凝固。5.检样的吸取：用三支1mL无菌移液管分别吸取10、10和10的稀释菌悬液各0.1mL，对号接入与之对应的3个无菌平皿中，尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于试验台上20min；待样液吸收后倒置平皿于40℃恒温箱中培养48h。6.菌落观察：取出已培养48h培养平皿；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进行观察，初步找出典型的乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约1-3mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。7.镜检：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂片，经革兰氏染色后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌：其中乳酸杆菌皇杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状，（二）乳酸菌的鉴别1.选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养8～24h。5
5 超净工作台、恒温培养箱、鼓风干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、冰箱、油镜、显微镜、碱 式滴定仪、天平、培养皿、1mL 和 10mL 移液管、试管、烧杯、量筒、温度计、酒精灯、接 种针、涂布器、载玻片、涂布棒、250mL 三角瓶、滤纸条等。 五、 实验方法与步骤 （一）乳酸菌的分离 1. 菌悬液的配制：取一洁净三角瓶，盛以 225mL 生理盐水；6 支洁净试管，各盛 9mL 的 生理盐水；加塞包扎于 121℃高压蒸汽灭菌 20min，得到无菌生理盐水。 2. 将酸奶样品搅拌均匀，用 10mL 无菌移液管吸取样品 25ml 加入盛有 225ml 无菌生理盐 水的三角瓶中，充分振摇，使样品均匀分散，即为 1:10 的均匀稀释液； 3. 将 6 支装 9mL 生理盐水的无菌试管，依次标记 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，取 1mL 无菌移液管吸 1:10 的菌悬液沿管壁徐徐注入装有 9mL 灭菌生理盐水的试管中，稀 释混匀便得到 1:100 稀释液，按上述操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释 一次即换用 1 支 1mL 吸管。根据样品情况，制得 10-3～10-7 的稀释液。 4. 倒平板：取无菌平皿 9 个，编号标明 10-5、10-6、10-7 各三套；按无菌操作将经高温消 毒冷却到 50℃左右的培养基注入 9 个平皿，每皿约 15mL；转动平皿，使培养基均匀分 布在皿底，待凝固。 5. 检样的吸取：用三支 1 mL 无菌移液管分别吸取 10-5、10-6 和 10-7 的稀释菌悬液各 0.1 mL，对号接入与之对应的 3 个无菌平皿中，尽快用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂布 均匀，平放于试验台上 20min；待样液吸收后倒置平皿于 40℃恒温箱中培养 48 h。 6. 菌落观察：取出已培养 48 h 培养平皿；选择菌落分布较好的平板，先对其菌落形态进 行观察，初步找出典型的乳酸菌菌落。乳酸菌的菌落很小，大约 1-3mm，圆形隆起， 表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。 7. 镜检：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴生理盐水，无菌操作法取少量菌体涂 片，经革兰氏染色后用油镜观察，菌体被染成蓝紫色的是乳酸菌；其中乳酸杆菌呈杆 状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。 （二）乳酸菌的鉴别 1. 选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中，40℃培养 8～24h
2.观察与测定：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色，显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。（1）观察并记录各试管的凝乳时间（2）酸度测定：用NaOH滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度滴定酸度：吸取10ml牛乳，置于250ml三角瓶中，加入20ml水，再加入0.5m10.5%的酚乙醇溶液，小心摇匀，用0.1mo1/L氢氧化钠标准溶液滴至微红色（见注），在1min内不消失为止。消耗0.1mo1/L氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以10，即得酸度。注：滴定酸度终点判定标准颜色的制备方法如下。取滴定酸度测定的同批和同样数量的样品如牛乳10ml，置于250ml三角烧瓶中，加人20ml蒸馏水，再加入3滴0.005%碱性品红溶液，摇匀后作为该样品滴定酸度终点判定的标准颜色。其他产品酸度滴定的标准颜色的制备，可根据其标准滴定酸度测定的取样量和加水稀释量的总容积，参照本方法按比例增加或减少0.005%碱性品红滴数即可。（3）计数：采用注平板法，测定菌落数量实验结果六、1.菌种培养观察并记录结果时间10-510-610-7观察并记录菌落观察48h镜检形态2.脱脂乳发酵观察与测定时间/h凝乳状态酸度测定活菌计数24七、革兰氏染色注意事项1．涂片不宜过厚，且应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这样更能观察细菌的形态。6
6 2. 观察与测定：为了便于测定乳酸发酵情况，取脱脂乳试管中的溶液进行革兰氏染色， 显微镜检查。革兰氏阳性，无芽胞的球菌或杆菌可定为乳酸菌，记录测定结果。 （1）观察并记录各试管的凝乳时间 （2）酸度测定：用 NaOH 滴定法，测定发酵乳液的滴定酸度 滴定酸度：吸取 10ml 牛乳，置于 250ml 三角瓶中，加入 20ml 水，再加入 0.5m1 0.5% 的酚酞乙醇溶液，小心摇匀，用 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液滴至微红色（见注），在 1 min 内不消失为止。消耗 0.1mol/L 氢氧化钠标准溶液的毫升数乘以 10，即得酸度。 注：滴定酸度终点判定标准颜色的制备方法如下。 取滴定酸度测定的同批和同样数量的样品如牛乳 10ml，置于 250 ml 三角烧瓶中，加 人 20ml 蒸馏水，再加入 3 滴 0.005%碱性品红溶液，摇匀后作为该样品滴定酸度终点判定 的标准颜色。 其他产品酸度滴定的标准颜色的制备，可根据其标准滴定酸度测定的取样量和加水稀 释量的总容积，参照本方法按比例增加或减少 0.005%碱性品红滴数即可。 （3）计数：采用倾注平板法，测定菌落数量 六、 实验结果 1. 菌种培养观察并记录结果 时间 观察并记录 10-5 10-6 10-7 48h 菌落观察 镜检形态 2. 脱脂乳发酵观察与测定 时间/h 凝乳状态 酸度测定 活菌计数 24 七、 革兰氏染色注意事项 1. 涂片不宜过厚，且应将它涂均匀，如果太粘稠就用无菌水进行稀释，这样更能观察细 菌的形态
2.染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。3.染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。另外，时间长短还与涂片薄厚、乙醇用量有关。染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态7
7 2. 染色过程中，染液要覆盖菌体，用水冲洗时应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释 影响染色结果，且水流不宜过大，以免菌体被冲走。 3. 染色成败关键是脱色的时间，时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌，脱 色过度，革兰氏阳性菌也会被染成革兰氏阴性菌。另外，时间长短还与涂片薄厚、乙 醇用量有关。染色不宜过深，这样不利于观察细菌的形态