实验五枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育实验目的一、通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。二、实验原理物理诱变因子以紫外线辐射的使用最为普遍，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。在紫外线的波长在200-380nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253-265cm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。紫外线诱变得主要生物学效应是由于DNA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中嘧啶更为敏感。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。三、实验材料及试剂1.菌种：枯草芽孢杆菌；2.器皿：紫外线灯（15W）；试管、锥形瓶、移液管、玻璃珠、培养皿；3.培养基及药品：蛋白陈10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，碘液。四、实验方法与步骤1.菌悬液的制备：取培养48小时的活化枯草芽孢杆菌的斜面1一2支，用10ml无菌生理盐水将菌苔洗下，并入盛有灭菌玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡10分钟，以打碎菌块。菌悬液以10倍稀释法稀释成10-10*稀释液。2.平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至55℃左右时倒平板，凝固后待用。3.紫外线处理：（1）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。(2）取直径6cm无菌平皿9套，涂平板取10°、10、10-三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。(3）将盛有菌悬液的平皿置于紫外线灯下分别搅拌照射0分钟、3分钟及5分钟。13
13 实验五 枯草芽孢杆菌的紫外线诱变选育 一、 实验目的 通过实验，观察紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应，并学习物理因素诱变育种的方法。 二、 实验原理 物理诱变因子以紫外线辐射的使用最为普遍，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现 和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌中， 有 80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。在紫外线的波长在 200-380nm 之间，但 对诱变最有效的波长仅仅是在 253-265cm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有 80%是 254nm。紫外线诱变得主要生物学效应是由于 DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸 收作用，尤其是碱基中嘧啶更为敏感。经紫外线损伤的 DNA，能被可见光复活，因此，经 诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用 黑纸或黑布包裹。 三、 实验材料及试剂 1. 菌种：枯草芽孢杆菌； 2. 器皿：紫外线灯（15W）；试管、锥形瓶、移液管、玻璃珠、培养皿； 3. 培养基及药品：蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，氯化钠 5g，可溶性淀粉 2g，琼脂 20g，蒸馏 水 1000mL，碘液。 四、 实验方法与步骤 1. 菌悬液的制备： 取培养 48 小时的活化枯草芽孢杆菌的斜面 1—2 支，用 10ml 无菌生 理盐水将菌苔洗下，并入盛有灭菌玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡 10 分钟，以打碎菌块。 菌悬液以 10 倍稀释法稀释成 10-1 -10-8 稀释液。 2. 平板制作：将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至 55℃左右时倒平板，凝固后待用。 3. 紫外线处理： （1）将紫外线灯开关打开预热约 20 分钟。 (2) 取直径 6cm 无菌平皿 9 套，涂平板取 10-6、10-7、10-8 三个稀释度涂平板，每个稀 释度涂平板 3 只，每只平板加稀释菌液 0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。 (3) 将盛有菌悬液的平皿置于紫外线灯下分别搅拌照射 0 分钟 、3 分钟及 5 分钟
4.培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。5.计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理3分钟、5分钟、7分钟后的存活细胞数及其存活/致死率。处理后每毫升活菌数存活率=X100对照每亮升活菌数对照每毫升活菌数-处理后每毫升活菌数致死率=X100对照每毫升活菌数6.观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5～6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。五、实验结果将实验结果填入下表表1诱变结果（存活率或致死率）诱变剂诱变时间（分钟）稀释倍数存活率或致死率(%)10-810-61070（对照）3紫外线5(UV)714
14 4. 培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置 37℃培养 48 小时。注意每个 平皿背面要标明处理时间和稀释度。 5. 计数：将培养 48 小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每 毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理 3 分钟、5 分钟、7 分钟后的存活细胞数 及其存活/致死率。 6. 观察诱变效应：将细胞计数后的平板，分别向菌落数在 5～6 个左右的平板内加碘液数 滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC 值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取 HC 比值大的菌落移接 到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 五、 实验结果 将实验结果填入下表 表 1 诱变结果（存活率或致死率） 诱变剂 诱变时间（分钟） 稀释倍数 存活率或致死率(%) 10-6 10-7 10-8 紫外线 （UV） 0（对照） 3 5 7
表2诱变结果（透明圈和菌落直径大小）透明圈和菌落直径大小（mm）及其HC比值0分钟3分钟5分钟7分钟菌透透菌菌透HC菌HCHC透HC落比落比落明落比明明明比圈值圈值圈值圈值UV处理对照六、思考题1用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？2.经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？15
15 表 2 诱变结果（透明圈和菌落直径大小） 透明圈和菌落直径大小（㎜）及其 HC 比值 0 分钟 3 分钟 5 分钟 7 分钟 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 透 明 圈 菌 落 HC 比 值 UV 处理 对照 六、 思考题 1. 用于诱变的菌悬液（或孢子悬液）为什么要充分振荡？ 2. 经紫外线处理后的操作和培养为什么要在暗处或红光下进行？
实验六枯草芽孢杆菌生长曲线的测定一、实验目的了解比浊计数法原理，学习掌握光电比浊计数法的操作方法，通过细菌光密度的测量，了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线。二、基本原理当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。在一定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池准确测出。测定细菌浊度，光波通常选择400-700mm。光电比浊计数法的优点是简便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。大多数细菌的繁殖速度很快。将一定的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延退期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线也不同。测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长具有重要意义。三、实验材料和仪器1.菌种：枯草芽孢杆菌2：培养基：蛋白陈10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，可溶性淀粉2g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。3.仪器：755型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。四、实验方法与步骤1.接种：用接种环接种一环枯草芽孢杆菌到盛有6ml液体培养基的试管中，30℃120rpm摇床振荡过夜培养。2：转接及取样：将上述培养液接种到盛有50mL液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm摇床振荡培养，每隔4小时用无菌吸管取样3ml测定比浊。3.OD6oo测定：用未接种的液体培养基作空白对照，选用600nm波长进行光电比浊测定。（注：这里以水为对照，测定空白培养基的OD值，最后把这个差减去即可。）五、结果分析及讨论16
16 实验六 枯草芽孢杆菌生长曲线的测定 一、 实验目的 了解比浊计数法原理，学习掌握光电比浊计数法的操作方法，通过细菌光密度的测量， 了解细菌生长特征和规律，绘制生长曲线。 二、 基本原理 当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的通过量降低。在一 定范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由 光电池准确测出。测定细菌浊度，光波通常选择 400-700nm。光电比浊计数法的优点是简 便、迅速，可以连续测定，适合于自动控制。 大多数细菌的繁殖速度很快。将一定的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下 培养细胞要经历延迟期，对数生长期、稳定期/衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以 细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细 菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同培养条件下所绘制的生长曲线 也不同。测定细菌的生长曲线，了解其生长规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用 和控制细菌的生长具有重要意义。 三、 实验材料和仪器 1． 菌种：枯草芽孢杆菌 2． 培养基：蛋白胨 10g，牛肉膏 3g，氯化钠 5g，可溶性淀粉 2g，琼脂 20g，蒸馏水 1000mL。 3． 仪器：755 型分光光度计，振荡摇床，无菌吸管等。 四、 实验方法与步骤 1． 接种：用接种环接种一环枯草芽孢杆菌到盛有 6ml 液体培养基的试管中，30℃120rpm 摇床振荡过夜培养。 2． 转接及取样 ：将上述培养液接种到盛有 50mL 液体培养基的三角瓶内，30℃120rpm 摇 床振荡培养，每隔 4 小时用无菌吸管取样 3ml 测定比浊。 3． OD600 测定：用未接种的液体培养基作空白对照，选用 600nm 波长进行光电比浊测定。 （注：这里以水为对照，测定空白培养基的 OD 值，最后把这个差减去即可。） 五、 结果分析及讨论
1.将测定的ODg填入下表：4812162024培养时间（hr）对照0光密度（OD6oo）2.绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线ODeoo值+t以培养时间为横坐标，以ODo为纵坐标作图绘制土壤杆菌的生长曲线，找出生长时间及生长量的关系，区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期。六、思考题1.光电比浊计数的原理是什么？如何区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期，并说出不同培养时期的培2..养特征。17
17 1． 将测定的 OD600 填入下表： 培养时间（hr） 对照 0 4 8 12 16 20 24 光密度（OD600） 2． 绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线 t 以培养时间为横坐标，以 OD600 为纵坐标作图绘制土壤杆菌的生长曲线，找出生长时间 及生长量的关系，区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期。 六、思考题 1. 光电比浊计数的原理是什么？ 2. 如何区分土壤杆菌的延迟期、指数生长期、稳定期、衰亡期，并说出不同培养时期的培 养特征。 OD600值