H H G o-P-0 中=0 d 图2A-T,G-C间的氢键形成 (4DNA双螺旋中的两股链走向是反平行的,一股链是5→3走向,另一股链是 3’→5走向。两股链之间在空间上形成一条大沟( major groove)和一条小沟( minor groove),这是蛋白质识别DNA的碱基序列,与其发生相互作用的基础。 DNA双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力 ( base stacking force)维系。DNA双螺旋中两股链中碱基互补的特点,逻辑地预 示了DNA复制过程是先将DNA分子中的两股链分离开,然后以每一股链为模 板(亲本),通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本),形成两个完全相同的 DNA分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链,即保留了一半亲链,将 这种复制方式称为DNA的半保留复制( semi conservative replication)。后来证明, 半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式 DNA双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论支配了近代核酸结构 功能的研究和发展,是生命科学发展史上的杰出贡献。 (二)DNA结构的多态性
图 2 A－T，G－C 间的氢键形成 (4)DNA 双螺旋中的两股链走向是反平行的，一股链是 5′→3′走向，另一股链是 3′→5′走向。两股链之间在空间上形成一条大沟(major groove)和一条小沟(minor groove)，这是蛋白质识别 DNA 的碱基序列，与其发生相互作用的基础。 DNA 双螺旋的稳定由互补碱基对之间的氢键和碱基对层间的堆积力 (base stacking force)维系。DNA 双螺旋中两股链中碱基互补的特点，逻辑地预 示了 DNA 复制过程是先将 DNA 分子中的两股链分离开，然后以每一股链为模 板(亲本)，通过碱基互补原则合成相应的互补链(复本)，形成两个完全相同的 DNA 分子。因为复制得到的每对链中只有一条是亲链，即保留了一半亲链，将 这种复制方式称为 DNA 的半保留复制(semi conservative replication)。后来证明， 半保留复制是生物体遗传信息传递的最基本方式。 DNA 双螺旋是核酸二级结构的重要形式。双螺旋结构理论支配了近代核酸结构 功能的研究和发展，是生命科学发展史上的杰出贡献。 (二)DNA 结构的多态性
Watson和Crik提出的DNA双螺旋结构属于B型双螺旋,它是以在生理盐溶液 中抽出的DNA纤维在92%相对湿度下进行X一射线衍射图谱为依据进行推测 的,这是DNA分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构。然而以后的研究表 明DNA的结构是动态的。在以钾或绝作反离子,相对湿度为75%时,DNA分 子的ⅹ一射线衍射图给出的是A构象,A一DNA每螺旋含11个碱基对,而且变 成A-DNA后,大沟变窄、变深,小沟变宽、变浅。由于大沟、小沟是DNA行 使功能时蛋白质的识别位点,所以由BDNA变为A-DNA后,蛋白质对DNA 分子的识别也发生了相应变化 般说来,A一T丰富的DNA片段常呈B→DNA。采用乙醇沉淀法纯化DNA时, 整个过程中,大部分DNA由B一DNA经过C一DNA,最终变构为A一DNA 若DNA双链中一条链被相应的RNA链所替换,会变构成A一DNA。当DNA处 于转录状态时,DNA模板链与由它转录所得的RNA链间形成的双链就是A DNA。由此可见A-DNA构象对基因表达有重要意义。此外,B一DNA双链都 被RNA链所取代而得到由两条RNA链组成的双螺旋结构也是A-DNA。除A DNA、B一DNA螺旋外,还存在B′一DNA、C-DNA、D-DNA等,其结构 参数见表2。 表2不同右手双螺旋DNA的结构参数 双螺旋碱基倾碱基夹碱基间距螺距每轮碱小沟宽/nmx大沟宽nmx 角/(°)角(°)/nm /nm基数小沟宽nm大沟宽nm B-DNA O 36.00.3373.410 0.57×0.75 1.17×0.85 C-dnA 6 38.00.3313.19.3048×0.79 1.05×0.75 D-DNA 45.00.303 0.13×0.670.89×0.58 A-Dan 2 32.70.2562.811 10×0.280.27×1.35 总之,DNA的双螺旋结构永远处于动态平衡中,DNA分子构象的变化与糖基和 碱基之间空间相对位置有关
Watson 和 Crick 提出的 DNA 双螺旋结构属于 B 型双螺旋，它是以在生理盐溶液 中抽出的 DNA 纤维在 92%相对湿度下进行 X－射线衍射图谱为依据进行推测 的，这是 DNA 分子在水性环境和生理条件下最稳定的结构。然而以后的研究表 明 DNA 的结构是动态的。在以钾或绝作反离子，相对湿度为 75%时，DNA 分 子的 X－射线衍射图给出的是 A 构象，A－DNA 每螺旋含 11 个碱基对，而且变 成 A－DNA 后，大沟变窄、变深，小沟变宽、变浅。由于大沟、小沟是 DNA 行 使功能时蛋白质的识别位点，所以由 B－DNA 变为 A－DNA 后，蛋白质对 DNA 分子的识别也发生了相应变化。 一般说来，A－T 丰富的 DNA 片段常呈 B－DNA。采用乙醇沉淀法纯化 DNA 时， 整个过程中，大部分 DNA 由 B－DNA 经过 C－DNA，最终变构为 A－DNA。 若 DNA 双链中一条链被相应的 RNA 链所替换，会变构成 A－DNA。当 DNA 处 于转录状态时，DNA 模板链与由它转录所得的 RNA 链间形成的双链就是 A－ DNA。由此可见 A－DNA 构象对基因表达有重要意义。此外，B－DNA 双链都 被 RNA 链所取代而得到由两条 RNA 链组成的双螺旋结构也是 A－DNA。除 A －DNA、B－DNA 螺旋外，还存在 B′－DNA、C－DNA、D－DNA 等，其结构 参数见表 2。 表 2 不同右手双螺旋 DNA 的结构参数 双螺旋 碱基倾 碱基夹 碱基间距 螺距 每轮碱 小沟宽／nm× 大沟宽 nm× 角／（°） 角（°） /nm ／nm 基数 小沟宽 nm 大沟宽 nm B-DNA 0 36.0 0.337 3.4 10 0.57×0.75 1.17×0.85 C-DNA 6 38.0 0.331 3.1 9.3 0.48×0.79 1.05×0.75 D-DNA 45.0 0.303 0.13×0.67 0.89×0.58 A-DAN 20 32.7 0.256 2.8 11 1.10×0.28 0.27×1.35 总之，DNA 的双螺旋结构永远处于动态平衡中，DNA 分子构象的变化与糖基和 碱基之间空间相对位置有关
979年,Wang和Rich等人在研究人工合成的 CGCGCG单晶的X-射线衍射图 谱时出人意料地发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺 旋,与右手螺旋的不同是螺距延长(4.5nm左右,直径变窄(l8nm),每个螺旋含 12个碱基对,分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿形排列,有如“之”字形 样,因此叫它Z构象(英文字 Zigzag的第一个字母)。还有,这一构象中的重复 单位是二核苷酸而不是单核苷酸:;而且ZDNA只有一个螺旋沟,它相当于B 构象中的小沟,它狭而深,大沟则不复存在(图3)。进一步的分析还证明,Z DNA的形成是DNA单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。比如 CGCGCGCO 或者 CACACACA R一1NA 图3Z-DNA和B-DNA Z-DNA有什么生物学意义呢?应当指出Z一DNA的形成通常在热力学上是不利 的。因为Z一DNA中带负电荷的磷酸根距离太近了,这会产生静电排斥。但是, DNA链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。DNA解螺旋却是DNA 复制和转录等过程中必要的环节,因此认为这一结构与基因调节有关。比如Sⅴ40 增强子区中就有此结构,又如鼠类微小病毒DNS复制区起始点附近有GC交替 排列序列。此外,DNA螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。调控 蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与DNA双螺旋沟中的碱基对一侧的氢
1979 年，Wang 和 Rich 等人在研究人工合成的 CGCGCG 单晶的 X-射线衍射图 谱时出人意料地发现这种六聚体的构象与上面讲到的完全不同。它是左手双螺 旋，与右手螺旋的不同是螺距延长(4.5nm 左右)，直径变窄(1.8nm)，每个螺旋含 12 个碱基对，分子长链中磷原子不是平滑延伸而是锯齿形排列，有如“之”字形 一样，因此叫它 Z 构象(英文字 Zigzag 的第一个字母)。还有，这一构象中的重复 单位是二核苷酸而不是单核苷酸；而且 Z DNA 只有一个螺旋沟，它相当于 B 构象中的小沟，它狭而深，大沟则不复存在(图 3)。进一步的分析还证明，Z－ DNA 的形成是 DNA 单链上出现嘌呤与嘧啶交替排列所成的。比如 CGCGCGCG 或者 CACACACA。 图 3 Z－DNA 和 B－DNA Z－DNA 有什么生物学意义呢?应当指出 Z－DNA 的形成通常在热力学上是不利 的。因为 Z－DNA 中带负电荷的磷酸根距离太近了，这会产生静电排斥。但是， DNA 链的局部不稳定区的存在就成为潜在的解链位点。DNA 解螺旋却是 DNA 复制和转录等过程中必要的环节，因此认为这一结构与基因调节有关。比如 SV40 增强子区中就有此结构，又如鼠类微小病毒 DNS 复制区起始点附近有 GC 交替 排列序列。此外，DNA 螺旋上沟的特征在其信息表达过程中起关键作用。调控 蛋白都是通过其分子上特定的氨基酸侧链与 DNA 双螺旋沟中的碱基对一侧的氢
原子供体或受体相互作用,形成氢键从而识别DNA上的遗传信息的。大沟所带 的遗传信息比小沟多。沟的宽窄和深浅也直接影响到调控蛋白质对DNA信息的 识别。ZDNA中大沟消失,小沟狭而深,使调控蛋白识别方式也发生变化。这 些都暗示ZDNA的存在不仅仅是由于DNA中出现嘌呤一啶嘧交替排列之结 果,也一定是在漫漫的进化长河中对DNA序列与结构不断调整与筛选的结果, 有其内在而深刻的含意,只是人们还未充分认识而己。 DNA构象的可变性,或者说DNA二级结构的多态性的发现拓宽了人们的视野 原来,生物体中最为稳定的遗传物质也可以采用不同的姿态来实现其丰富多采的 生物学功能。 多年来,DNA结构的研究手段主要是ⅹ射线衍射技术,其结果是通过间接观测 多个DNA分子有关结构参数的平均值而获得的。同时,这项技术的样品分析条 件使被测DNA分子与天然状态相差甚远。因此,在反映DNA结构真实性方面 这种方法存在着缺陷。1989年,应用扫描隧道显微镜( scanning tunneling microscopy, STM)研究DNA结构克服了上述技术的缺陷。这种先进的显微技术, 不仅可将被测物放大500万倍,且能直接观测接近天然条件下单个DNA分子的 结构细节。STM技术的应用是DNA结构研究中的重要进展,可望在探索DNA 结构的某些未知点上展示巨大潜力。 (三)DNA结构的不均一性( heterogeneity) 在DNA的一级结构中,四种碱基A,T,C,G远非均匀分布,尽管双螺旋的构 型大体相同,但沿着DNA链各处的物理结构不完全相同,各处双螺旋的稳定性 也就显示出差别,充分体现了DNA一级结构决定高级结构的原理。其不均一性 主要有: 1反向重复序列 averted repeats 又称回文序列( palindrome),它能在DNA或RNA中形成发夹结构。这种回文结 构通常是作为一种特别信号,如限制性核酸内切酸( (restriction enc闩迴 nuclease) 及调节蛋白的识别位点,转录终止信号等
原子供体或受体相互作用，形成氢键从而识别 DNA 上的遗传信息的。大沟所带 的遗传信息比小沟多。沟的宽窄和深浅也直接影响到调控蛋白质对 DNA 信息的 识别。Z DNA 中大沟消失，小沟狭而深，使调控蛋白识别方式也发生变化。这 些都暗示 Z DNA 的存在不仅仅是由于 DNA 中出现嘌呤一啶嘧交替排列之结 果，也一定是在漫漫的进化长河中对 DNA 序列与结构不断调整与筛选的结果， 有其内在而深刻的含意，只是人们还未充分认识而已。 DNA 构象的可变性，或者说 DNA 二级结构的多态性的发现拓宽了人们的视野。 原来，生物体中最为稳定的遗传物质也可以采用不同的姿态来实现其丰富多采的 生物学功能。 多年来，DNA 结构的研究手段主要是 X 射线衍射技术，其结果是通过间接观测 多个 DNA 分子有关结构参数的平均值而获得的。同时，这项技术的样品分析条 件使被测 DNA 分子与天然状态相差甚远。因此，在反映 DNA 结构真实性方面 这种方法存在着缺陷。1989 年，应用扫描隧道显微镜(scanning tummeling microscopy,STM)研究 DNA 结构克服了上述技术的缺陷。这种先进的显微技术， 不仅可将被测物放大 500 万倍，且能直接观测接近天然条件下单个 DNA 分子的 结构细节。STM 技术的应用是 DNA 结构研究中的重要进展，可望在探索 DNA 结构的某些未知点上展示巨大潜力。 (三)DNA 结构的不均一性(heterogeneity) 在 DNA 的一级结构中，四种碱基 A，T，C，G 远非均匀分布，尽管双螺旋的构 型大体相同，但沿着 DNA 链各处的物理结构不完全相同，各处双螺旋的稳定性 也就显示出差别，充分体现了 DNA 一级结构决定高级结构的原理。其不均一性 主要有： 1.反向重复序列(inverted repeats) 又称回文序列(palindrome)，它能在 DNA 或 RNA 中形成发夹结构。这种回文结 构通常是作为一种特别信号，如限制性核酸内切酸(restriction encl 闩迥 onuclease) 及调节蛋白的识别位点，转录终止信号等
2富含A/T的序列 在高等生物中,A+T与G+C的含量差不多相等,然而在它们的染色体某一区域, AT含量可能相当高。如在很多有重要调节功能的DNA区段都富含A·T,特别 是在复制起点和启动子的 Pribnow框(真核生物为TATA框)的序列中,其对于复 制和起始十分重要。因为A一T对只有二条氢键,此处的双链较G-C对处易于 解开,有利于起始复合物的形成 3.嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响 人们考察了十种相邻的二核苷酸对( nearest neighbor doublets),发现一个非常有 趣的现象,那就是碱基组成相同,但嘌呤和嘧啶的排列顺序不同,双螺旋的稳定 性具有显著的差异。例如5GC3′3G5和5GC3′3GC5的稳定性相差很大, 前者的稳定性远大于后。它们的氢键数目是相同的,它们的差别在于相邻碱基之 间的堆集力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著地大于同样组成的 嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。(这里的方向就是常规的从5端到3′端的方向) 这是因为前者的嘌呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面 积,这在B型DNA中确是如此。 根据 Gotoh1981年的研究,十种相邻二核苷酸对的Tm值如表3所示,单位为℃, 所用离子强度为195 mmol/L Na+ 表3相邻二核苷酸对Tm值 57.02 97.73 T36.73 86.44 G86.4 97.73 85.97 136.12 58.42 8597
2.富含 A/T 的序列 在高等生物中，A+T 与 G＋C 的含量差不多相等，然而在它们的染色体某一区域， A·T 含量可能相当高。如在很多有重要调节功能的 DNA 区段都富含 A·T，特别 是在复制起点和启动子的 Pribnow 框(真核生物为 TATA 框)的序列中，其对于复 制和起始十分重要。因为 A－T 对只有二条氢键，此处的双链较 G－C 对处易于 解开，有利于起始复合物的形成。 3.嘌呤和嘧啶的排列顺序对双螺旋结构稳定性的影响。 人们考察了十种相邻的二核苷酸对(nearest neighbor doublets)，发现一个非常有 趣的现象，那就是碱基组成相同，但嘌呤和嘧啶的排列顺序不同，双螺旋的稳定 性具有显著的差异。例如 5′GC 3′ 3′G 5′和 5′GC 3′ 3′GC 5′的稳定性相差很大， 前者的稳定性远大于后。它们的氢键数目是相同的，它们的差别在于相邻碱基之 间的堆集力不同。即从嘌呤到嘧啶的方向的碱基堆集作用显著地大于同样组成的 嘧啶到嘌呤方向的碱基堆集作用。(这里的方向就是常规的从 5′端到 3′端的方向)。 这是因为前者的嘌呤环和嘧啶环重迭面积大于后者的嘧啶环和嘌呤环的重迭面 积，这在 B 型 DNA 中确是如此。 根据 Gotoh 1981 年的研究，十种相邻二核苷酸对的 Tm 值如表 3 所示，单位为℃， 所用离子强度为 19.5mmol/L Na＋。 表 3 相邻二核苷酸对 Tm 值 3′ A T G C 5′ A 54.50 57.02 58.42 97.73 T 36.73 54.50 54.71 86.44 G 86.44 97.73 85.97 136.12 C 54.71 58.42 72.55 85.97