由表15-5可以看到,5'TA3’′3^AT5'的Tm值最低。在真核生物中,常可以在19 到27的位置上看到一个叫做TATA框的结构(又称 Hogness框),这是RNA聚 合酶的结合位点。在这里RNA聚合酶和有关蛋白质因子形成转录起始复合物。 又如,生命有机体选择UAA作为最有效的终止密码子绝不是偶然的,因为64 个三联体密码子中,它与反密码子(假定有的话形成的互补产物5UAA3 3’AUU5'的Tm值是最低的一个,即使在生理温度下也是不稳定的。当初有人花 了很多工夫去寻找一个不携带氨基酸的专供肽链终止用的tRNA,其实并不存在 这种tRNA。肽链的释放是由释放因子RF在起作用。在三种终止密码子中,UAG 和UGA常会为突变型的tRNA无义抑制,而UAA则很少发生无义抑制也可能 就是这个道理。这也就说明了为什么在肽链终止处常常会出现双重终止密码子 (四DNA的变性、复性与分子杂交 DNA双螺旋结构模型,不仅与其生物功能有密切关系,还能解释DNA的重要特 性棗变性与复性,这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系又有重要意义。 1DNA变性( denaturation 指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双 螺旋稳定性的氢键断裂,碱基间的堆积力遭到破坏,但不涉及到其一级结构的改 变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素,如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇 尿素及甲酰胺等,均可引起核酸分子变性。变性DNA常发生一些理化及生物学 性质的改变 溶液粘度降低。DNA双螺旋是紧密的刚性结构,变性后代之以柔软而松散的无 规则单股线性结构,DNA粘度因此而明显下降。 溶液旋光性发生改变。变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变, 使DNA溶液的旋光性发生变化
由表 15-5 可以看到，5′TA 3′ 3′AT5′的 Tm 值最低。在真核生物中，常可以在 19 到 27 的位置上看到一个叫做 TATA 框的结构(又称 Hogness 框)，这是 RNA 聚 合酶的结合位点。在这里 RNA 聚合酶和有关蛋白质因子形成转录起始复合物。 又如，生命有机体选择 UAA 作为最有效的终止密码子绝不是偶然的，因为 64 个三联体密码子中，它与反密码子(假定有的话)形成的互补产物 5′UAA3′ 3′AUU5′的 Tm 值是最低的一个，即使在生理温度下也是不稳定的。当初有人花 了很多工夫去寻找一个不携带氨基酸的专供肽链终止用的 tRNA，其实并不存在 这种 tRNA。肽链的释放是由释放因子 RF 在起作用。在三种终止密码子中，UAG 和 UGA 常会为突变型的 tRNA 无义抑制，而 UAA 则很少发生无义抑制也可能 就是这个道理。这也就说明了为什么在肽链终止处常常会出现双重终止密码子。 (四)DNA 的变性、复性与分子杂交 DNA 双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释 DNA 的重要特 性棗变性与复性，这对于深入了解 DNA 分子结构与功能的关系又有重要意义。 1.DNA 变性(denaturation) 指 DNA 分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。变性时维持双 螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改 变。凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的 pH、有机试剂甲醇、乙醇、 尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。变性 DNA 常发生一些理化及生物学 性质的改变： 溶液粘度降低。DNA 双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无 规则单股线性结构，DNA 粘度因此而明显下降。 溶液旋光性发生改变。变性后整个 DNA 分子的对称性及分子局部的构性改变， 使 DNA 溶液的旋光性发生变化
oD26nm 070 065 0.55 808489%100℃ 图4核酸的解链曲线 增色效应( hyperchromic effect。指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。 DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的 特性。在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧,变性时DNA双螺旋解开,于是碱 基外露,碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收,故而产生增色效应。 对双链DNA进行加热变性,当温度升高到一定高度时,DNA溶液在260nm处 的吸光度突然明显上升至最高值,随后即使温度继续升高,吸光度也不再明显变 化。若以温度对DNA溶液的紫外吸光率作图,得到的典型DNA变性曲线呈S 型(图4)。可见DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变 性过程中,紫外光吸收值达到最大值的50%时的温度称为核酸的解链温度,由于 这一现象和结晶的融解相类似,又称融解温度(Im, melting temperature)。在Tm 时,核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G+C所 占总碱基数的百分比成正相关,两者的关系可表示为: Tm=693+0.41(%G+C)
图 4 核酸的解链曲线 增色效应(hyperchromic effect)。指变性后 DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。 DNA 分子中碱基间电子的相互作用使 DNA 分子具有吸收 260nm 波长紫外光的 特性。在 DNA 双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时 DNA 双螺旋解开，于是碱 基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。 对双链 DNA 进行加热变性，当温度升高到一定高度时，DNA 溶液在 260nm 处 的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，吸光度也不再明显变 化。若以温度对 DNA 溶液的紫外吸光率作图，得到的典型 DNA 变性曲线呈 S 型(图 4)。可见 DNA 变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变 性过程中，紫外光吸收值达到最大值的 50%时的温度称为核酸的解链温度，由于 这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm,melting temperature)。在 Tm 时，核酸分子内 50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的 Tm 值与其 G＋C 所 占总碱基数的百分比成正相关，两者的关系可表示为： Tm=69.3＋0.41(%G+C)
定条件下(相对较短的核酸分子),Tm值大小还与核酸分子的长度有关,核酸 分子越长,Tm值越大;另外,溶液的离子强度较低时,Tim值较低,融点范围 也较宽,反之亦然,因此DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 2DNA复性( renaturation) 指变性DNA在适当条件下,二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现 象,它是变性的一种逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过 程称之为退火 anneal ing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA 的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因素的影响: 温度和时间。一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件,越远离此 温度,复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程,若在超过Tm的温 度下迅速冷却至低温(如4℃以下),复性几乎是不可能的,核酸实验中经常以此 方式保持DNA的变性(单链态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复 性 DNA浓度。溶液中DNA分子越多,相互碰撞结合的机会越大 DNA顺序的复杂性。简单顺序的DNA分子,如多聚(A和多聚(U这二种单链序 列复性时,互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补,则困难得 多。在核酸复性研究中,定义了一个Cot的术语,(Co为单链DNA的起始浓度, t是以秒为单位的时间),用以表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。在探讨 DNA顺序对复性速度的影响时,将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它 影响因素均予以固定,以不同程度的核酸分子重缔合部分(在时间t时的复性率) 对Cot作图,可以得到如图5所示的曲线。曲线上方为示复杂性的核酸分子的非 重复碱基对数。如多聚(A)的复杂性为1,重复的( ATGC)n组成的多聚体的复杂 性为4,分子长度是105核苷酸对的非重复DNA的复杂性为105。原核生物基 因组均为非重复顺序,故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接体现基因组大小 (图上方的箭头所指为基因大小),对于真核生物基因组中的非重复片段也是如 此。在标准条件下(一般为0.18mL阳离子浓度,400核苷酸长的片段)测得的复 性率达0.5时的Cot值(称Cot2),与核苷酸对的复杂性成正比。对于原核生物
一定条件下(相对较短的核酸分子)，Tm 值大小还与核酸分子的长度有关，核酸 分子越长，Tm 值越大；另外，溶液的离子强度较低时，Tm 值较低，融点范围 也较宽，反之亦然，因此 DNA 制剂不应保存在离子强度过低的溶液中。 2.DNA 复性(renaturation) 指变性 DNA 在适当条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现 象，它是变性的一种逆转过程。热变性 DNA 一般经缓慢冷却后即可复性，此过 程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核酸分子的形成(见后)。DNA 的复性不仅受温度影响，还受 DNA 自身特性等其它因素的影响： 温度和时间。一般认为比 Tm 低 25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此 温度，复性速度就越慢。复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过 Tm 的温 度下迅速冷却至低温(如 4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此 方式保持 DNA 的变性(单链)状态。这说明降温时间太短以及温差大均不利于复 性。 DNA 浓度。溶液中 DNA 分子越多，相互碰撞结合的机会越大。 DNA 顺序的复杂性。简单顺序的 DNA 分子，如多聚(A)和多聚(U)这二种单链序 列复性时，互补碱基的配对较易实现。而顺序复杂的序列要实现互补，则困难得 多。在核酸复性研究中，定义了一个 Cot 的术语，(Co 为单链 DNA 的起始浓度， t 是以秒为单位的时间)，用以表示复性速度与 DNA 顺序复杂性的关系。在探讨 DNA 顺序对复性速度的影响时，将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它 影响因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重缔合部分(在时间 t 时的复性率) 对 Cot 作图，可以得到如图 5 所示的曲线。曲线上方为示复杂性的核酸分子的非 重复碱基对数。如多聚(A)的复杂性为 1，重复的(ATGC)n 组成的多聚体的复杂 性为 4，分子长度是 105 核苷酸对的非重复 DNA 的复杂性为 105。原核生物基 因组均为非重复顺序，故以非重复核苷酸对表示的复杂性直接体现基因组大小 (图上方的箭头所指为基因大小)，对于真核生物基因组中的非重复片段也是如 此。在标准条件下(一般为 0.18ml/L 阳离子浓度，400 核苷酸长的片段)测得的复 性率达 0.5 时的 Cot 值(称 Cot1/2)，与核苷酸对的复杂性成正比。对于原核生物
核酸分子,此值可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。真核基因 组中因含有许多不同程度的重复序列( repetitive sequence),所得到的Cot曲线更 为复杂。 核苷对 r"+ MS2 (非重复序列) 卫星DNA nmM删 LIMTuDamIL 10ot00 摩尔x秒/升) 图5不同物种核酸的Cot曲线 DNA的变性和复性原理,现已在医学和生命科学上得到广泛的应用。如核酸杂 交与探针技术,聚合酶链反应( polymerase chain reaction,PCR技术等 3分子杂交:( hybrid ization 不同来源的核酸变性后,合并在一处进行复性,这时,只要这些核酸分子的核苷 酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段,复性也会发生于不同来源的核酸链之 间,形成所谓的杂化双链 Cheterodup lex,这个过程称为杂交( hybridization)图6 I)。杂交可以发生于DNA与DNA之间,也可以发生于RNA与RNA之间和DNA 与RNA之间。例如,一段天然的DNA和这段DNA的缺失突变体(假定这种突 变是DNA分子中部丢失了若干碱基对)起杂交,电子显微镜下可以看到杂化双 链中部鼓起小泡。测量小泡位置和长度,可确定缺失突变发生的部位和缺失的多 少。核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一,不仅可用来检验核 酸的缺失、插入,还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序
核酸分子，此值可代表基因组的大小及基因组中核苷酸对的复杂程度。真核基因 组中因含有许多不同程度的重复序列(repetitive sequence)，所得到的 Cot 曲线更 为复杂。 图 5 不同物种核酸的 Cot 曲线 DNA 的变性和复性原理，现已在医学和生命科学上得到广泛的应用。如核酸杂 交与探针技术，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术等。 3.分子杂交：(hybridization) 不同来源的核酸变性后，合并在一处进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷 酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之 间，形成所谓的杂化双链(heterodup lex)，这个过程称为杂交(hybridization)图 6， I)。杂交可以发生于 DNA 与 DNA 之间，也可以发生于 RNA 与 RNA 之间和 DNA 与 RNA 之间。例如，一段天然的 DNA 和这段 DNA 的缺失突变体(假定这种突 变是 DNA 分子中部丢失了若干碱基对)一起杂交，电子显微镜下可以看到杂化双 链中部鼓起小泡。测量小泡位置和长度，可确定缺失突变发生的部位和缺失的多 少。核酸杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核 酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序
列以确定它们在进化中的关系。其应用当然远不止于确定突变位置这一例(图 6Ⅱ1) c=导 图6核酸杂交及其应用示意图 Ⅰ变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同DNA。A是杂化双链 ∏突变体的鉴别。B代表天然DNA;C是B的缺失突变体;虚线框内是已缺失 的部分; D是显示从天然DNA链鼓出小泡Ⅲ粗线代表探针,粗线上的X表示放射性 标记 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针 技术 Probe)。一小段(例如十数个至数百个)核苷酸聚合体的单链,有放射性同位 素如32P、35S或生物素标记其末端或全链,就可作为探针。把待测DNA变性 并吸附在一种特殊的滤膜,例如硝酸纤维素膜上。然后把滤膜与探针共同培育」 段时间,使发生杂交。用缓冲液冲洗膜。由于这种滤膜能较牢固地吸附双链的核 酸,单链的在冲洗时洗脱了。带有放射性的探针若能与待测DNA结合成杂化双 链,则保留在滤膜上。通过同位素的放射自显影或生物素的化学显色,就可判断 探针是否与被测的DNA发生杂交。有杂交现象则说明被测DNA与探针有同源
列以确定它们在进化中的关系。其应用当然远不止于确定突变位置这一例(图 6Ⅱ)。 图 6 核酸杂交及其应用示意图 Ⅰ.变性、复性和杂交。粗细线分别代表不同 DNA。A 是杂化双链 Ⅱ.突变体的鉴别。B 代表天然 DNA；C 是 B 的缺失突变体；虚线框内是已缺失 的部分； D 是显示从天然 DNA 链鼓出小泡 Ⅲ.粗线代表探针，粗线上的 X 表示放射性 标记 在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和诊断的非常有用的技术称探针 技术(Probe)。一小段(例如十数个至数百个)核苷酸聚合体的单链，有放射性同位 素如 32P、35S 或生物素标记其末端或全链，就可作为探针。把待测 DNA 变性 并吸附在一种特殊的滤膜，例如硝酸纤维素膜上。然后把滤膜与探针共同培育一 段时间，使发生杂交。用缓冲液冲洗膜。由于这种滤膜能较牢固地吸附双链的核 酸，单链的在冲洗时洗脱了。带有放射性的探针若能与待测 DNA 结合成杂化双 链，则保留在滤膜上。通过同位素的放射自显影或生物素的化学显色，就可判断 探针是否与被测的 DNA 发生杂交。有杂交现象则说明被测 DNA 与探针有同源