法及 Maxam和 Gilbert的化学降解法两大类。虽然原理不同,但这两种方法都同 样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸,每组寡核苷酸都有固定的起 点,但却随机终止于特定的一种或多种残基上。由于DNA链上每一个碱基出现 在可变终止端的机会均等,因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物,这 些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原DNA片段上的位置所决定。然后在可 以区分长度仅相差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下,对各组寡核苷酸进行 电泳分析,只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上,即可 从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺序。以下分别介绍。 1. Sanger双脱氧链终止法 DNA的合成总是从5端向3'端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引导核 酸链。DNA的合成过程中,在合成的DNA链的3′末端,依据碱基配对的原则 通过生成新的3′,5′一磷酸二酯键,使DNA链合成终止,产生短的DNA链。具 体测序工作中,平行进行四组反应,每组反应均使用相同的模板,相同的引物以 及四种脱氧核苷酸:并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸,使 其随机地接入DNA链中,使链合成终止,产生相应的四组具有特定长度的、不 同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离 开,经过放射自显影显示区带,就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列(图2)
法及 Maxam 和 Gilbert 的化学降解法两大类。虽然原理不同，但这两种方法都同 样生成互相独立的若干组带放射性标记的寡核苷酸，每组寡核苷酸都有固定的起 点，但却随机终止于特定的一种或多种残基上。由于 DNA 链上每一个碱基出现 在可变终止端的机会均等，因而上述每一组产物都是一些寡核苷酸的混合物，这 些寡核苷酸的长度由某一种特定碱基在原 DNA 片段上的位置所决定。然后在可 以区分长度仅相差一个核苷酸的不同 DNA 分子的条件下，对各组寡核苷酸进行 电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道之上，即可 从凝胶的放射自显影片上直接读出 DNA 上的核苷酸顺序。以下分别介绍。 1.Sanger 双脱氧链终止法 DNA 的合成总是从 5′端向 3′端进行的。DNA 的合成需要模板以及相应的引导核 酸链。DNA 的合成过程中，在合成的 DNA 链的 3′末端，依据碱基配对的原则， 通过生成新的 3′，5′－磷酸二酯键，使 DNA 链合成终止，产生短的 DNA 链。具 体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以 及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使 其随机地接入 DNA 链中，使链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不 同长短的 DNA 链。这四组 DNA 链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离 开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测 DNA 的核苷酸序列(图 2)
O=P-P-P-s 碱棒0mP--P50以碱基 2,3一双说昼酸 2一战氧核苷蛾 (MNTm INTP s dAdAdTdTdGdCdTdAdGdcdGdCdTdAdGdC3 3 dRrEdAlAdc<iIclGriATdcdGis dATP JAIP cATP dATP dGTP TP CTP cC TTP dTTp cTT打 d At. tiip ddGTP ddTTP s dAlAd TuTuGdCRiAoGde: c s'-dAAdTTuG3CNTCAcGdcdGdCdTdAddG G S'-dAdAITuTdGd(NIdAcGdddGdCdTdJA A S-dAdAdTaTdGdCdTdAdGdCdGdoddT y-d~ ITJTUGdc..AkGdc∞ s"-dAd命 NHGidciTaAdGacde S-dAdAdTTdGd Cd rdAdGddC 5-dAIadIdTdGdCdTdAddG s-dAdAdTuldGdCdTudA rcGcGAT daladTdTdGdCddT S-dAlAd'TlTuGdec s-dAdAdTdTddG s'-dAdAdrddT coTTA 二 s'aAdAduT Se-dAddA 所测厅列 图2双脱氧链终止法测定DNA序列原理示意 2 Maxam Gilbert dna化学降解法 这一方法的基本步骤为()先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素 32P;(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰:(3)在修饰 碱基位置化学法断开DNA链:(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开; (5)根据放射自显影显示区带,直接读出DNA的核苷酸序列(图3)
图 2 双脱氧链终止法测定 DNA 序列原理示意 2.Maxam Gilbert DNA 化学降解法 这一方法的基本步骤为(1)先将 DNA 的末端之一进行标记(通常为放射性同位素 32P；(2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰；(3)在修饰 碱基位置化学法断开 DNA 链；(4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将 DNA 链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出 DNA 的核苷酸序列(图 3)
5 HO-GATCGGACCT 3 单端放射同位素标记 〔此例为5一末端标记) S PGATOGACCT 3 不完争修饰 修饰G修馏G和A修饰T和C憶饰C 化学裂解 电泳分离 GG+A T+CC 全长核酸 "PGATOGGACC T 3'PGATOGGAC C "PGATCGGA C GATOGG囚 2 PGATOG囹 PGATC G oPGAT CI 1PGA团 FPGA □表示被修饰碱基及断烈位置 图3化学裂解法测定DNA的核苷酸序列 DNA的二级结构与功能 (一)DNA的二级结构双螺旋结构模型( double helix model) 1953年, Watson和 Crick提出了著名的DNA分子的双螺旋结构模型,揭示了遗 传信息是如何储存在DNA分子中,以及遗传性状何以在世代间得以保持。这是 生物学发展的重大里程碑
图 3 化学裂解法测定 DNA 的核苷酸序列 DNA 的二级结构与功能 (一)DNA 的二级结构 双螺旋结构模型(double helix model) 1953 年，Watson 和 Crick 提出了著名的 DNA 分子的双螺旋结构模型，揭示了遗 传信息是如何储存在 DNA 分子中，以及遗传性状何以在世代间得以保持。这是 生物学发展的重大里程碑
在DNA双螺旋结构模型建立之前,早在1868年, Miescher已经从脓细胞提取 到核酸与蛋白质的复合物,当时称为核素( nuclein)。但核酸在生命活动中的重要 地位,却迟至本世纪50年代才被认识 本世纪20年代, Levene研究了核酸的化学结构并提出四核苷酸假说:40年代末, Avery, Hershey和 Chase的实验严密地证实了DNA就是遗传物质;50年代初, Chargaff应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术,对多种生物DNA作碱基 定量分析,发现DNA碱基组成有如下规律(表1) 表1不同生物来源的DNA四种碱基比例关系 胸腺嘧啶 胞嘧啶(A+T)/ DNA来源腺嘌呤(A) 鸟嘌呤(G) (G+C) 大肠杆菌254 24.8 24.1 25.7 101 小麦 26.8 28.0 3.2 22.7 1.21 鼠 29.7 25.6 21.9 22.8 猪:肝294 20.5 20.5 胸腺 30.0 28.9 20.4 20.7 1.43 脾 29.6 20.4 20.8 酵母 18.7 1.079 (1)同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同: (2)一种生物DNA碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变; (3)几乎所有的DNA,无论种属来源如何,其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含 量相同(A]=[T),鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(G]=[C),总的嘌 呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同([A+G]=[C]+[T。 (4)不同生物来源的DNA碱基组成不同,表现在A+TG+C比值的不同 这些结果后来为DNA的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证
在 DNA 双螺旋结构模型建立之前，早在 1868 年，Miescher 已经从脓细胞提取 到核酸与蛋白质的复合物，当时称为核素(nuclein)。但核酸在生命活动中的重要 地位，却迟至本世纪 50 年代才被认识。 本世纪 20 年代，Levene 研究了核酸的化学结构并提出四核苷酸假说；40 年代末， Avery,Hershey 和 Chase 的实验严密地证实了 DNA 就是遗传物质；50 年代初， Chargaff 应用紫外分光光度法结合纸层析等简单技术，对多种生物 DNA 作碱基 定量分析，发现 DNA 碱基组成有如下规律(表 1)。 表 1 不同生物来源的 DNA 四种碱基比例关系 DNA 来源 腺嘌呤（A） 胸腺嘧啶 （T） 鸟嘌呤（G） 胞嘧啶 （C） （ A+T ） / （G+C） 大肠杆菌 25.4 24.8 24.1 25.7 1.01 小麦 26.8 28.0 23.2 22.7 1.21 鼠 29.7 25.6 21.9 22.8 1.21 猪：肝 29.4 29.7 20.5 20.5 胸腺 30.0 28.9 20.4 20.7 1.43 脾 29.6 29.2 20.4 20.8 酵母 31.3 32.9 18.7 17.5 1.079 (1)同一生物的不同组织的 DNA 碱基组成相同； (2)一种生物 DNA 碱基组成不随生物体的年龄、营养状态或者环境变化而改变； (3)几乎所有的 DNA，无论种属来源如何，其腺嘌呤摩尔含量与胸腺嘧啶摩尔含 量相同(A］=［T)，鸟嘌呤摩尔含量与胞嘧啶摩尔含量相同(G］=［C)，总的嘌 呤摩尔含量与总的嘧啶摩尔含量相同(［A＋G］=［C]＋［T)。 (4)不同生物来源的 DNA 碱基组成不同，表现在 A＋T/G＋C 比值的不同； 这些结果后来为 DNA 的双螺旋结构模型提供了一个有力的佐证
Watson和 Crick以立体化学原理为准则,对 Wilkins和 Frank lin的DNAX射线 衍射分析结果加以研究,提出了DNA结构的双螺旋模式,其主要内容如下: 5末编 3末 3末划 图1DNA的双螺旋结构模式 A.正面观:长方框内有详细说明,S代表脱氧核糖。 B.俯视:涂黑的是碱基,此处全部碱基都是嘧啶,只看到糖的侧面略呈三角形, 最外围是磷酸及其酯键。 (1)在DNA分子中,两股DNA链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构, 双螺旋的螺距为3.4nm,直径为2.0nm。(图1,A,B) (2)链的骨架( backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成,位于双 螺旋的外侧。 (3)碱基位于双螺旋的内侧,两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面 的环形结构彼此密切相近,平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的嘌呤碱基与 另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连,称为碱基互补配对或碱基 配对( base pairing),碱基对层间的距离为0.34nm。碱基互补配对总是出现于腺嘌 呤与胸腺嘧啶之间(A=η,形成两个氢键;或者出现于鸟嘌呤与胞嘧啶之间 (G=C,形成三个氢键。(图2)
Watson 和 Crick 以立体化学原理为准则，对 Wilkins 和 Franklin 的 DNA X 射线 衍射分析结果加以研究，提出了 DNA 结构的双螺旋模式，其主要内容如下： 图 1 DNA 的双螺旋结构模式 A.正面观：长方框内有详细说明，S 代表脱氧核糖。 B.俯视：涂黑的是碱基，此处全部碱基都是嘧啶，只看到糖的侧面略呈三角形， 最外围是磷酸及其酯键。 (1)在 DNA 分子中，两股 DNA 链围绕一假想的共同轴心形成一右手螺旋结构， 双螺旋的螺距为 3.4nm，直径为 2.0nm。(图 1, A，B)。 (2)链的骨架(backbone)由交替出现的、亲水的脱氧核糖基和磷酸基构成，位于双 螺旋的外侧。 (3)碱基位于双螺旋的内侧，两股链中的嘌呤和嘧啶碱基以其疏水的、近于平面 的环形结构彼此密切相近，平面与双螺旋的长轴相垂直。一股链中的嘌呤碱基与 另一股链中位于同一平面的嘧啶碱基之间以氢链相连，称为碱基互补配对或碱基 配对(base pairing)，碱基对层间的距离为 0.34nm。碱基互补配对总是出现于腺嘌 呤与胸腺嘧啶之间(A=T)，形成两个氢键；或者出现于鸟嘌呤与胞嘧啶之间 (G=C)，形成三个氢键。(图 2)