2.2先导化合物的修怖:药物设计与研发23 然而,生物电子等排也会改变药物活性或疔效,例如吩噻嗪类抗精神病药物2.40中的硫 原子被等排体一CH-CH-或一CH2CH2—置换,得到二苯并革抗抑郁药物2.43。电子等 排也会改变对酶的亲和力,例如,一系列含有噻唑啉酮环的抗炎化合物,对环氧合酶2同工 酶的选择性强于环氧合酶1同工酶(见第5章,5.5,2.2(2)节),若被嗯唑啉酮置换,则颠 倒了对这两个同工酶的选择性1]。 人们对生物电子等排之所以感兴趣,实际上是因其成功地应用于先导物的优化。仔细研究 表22特别是表23中的内容,可清楚地看到在生物电子等排置换时,会发生如下的一种或多 种参数的变化:分子的大小、形状、电性分布、脂溶性、水溶性、pK、化学反应性和氢键 等。因为药物必须到达作用部位后,才能与靶标发生相互作用(见第3章),而生物电子等排 的变换对化合物可以有以下一种或多种影响 ①结构的影响。如果被生物电子等排体置换的片断,其作用是在结构上维持其他功能基 的特定几何形状,则分子的大小、形状和氢键会有重要影响。 ②与受体的相互作用。如果被置换的片断参与了与受体或酶的特定相互作用,则除脂溶 性和水溶性外的所有的参数都是重要的。 ③药代动力学。如果被置换的片断为化合物的吸收、转运和排泄所必需,则亲脂性、亲 水性、pK和氢键是重要的 ④代谢。如果被置换的片断参与了阻断或促进代谢作用,则化学反应性是重要的 生物电子等排的有效性就是因为会引起这些精细的变化。药物化学家用这种方法只调整某 些参数,以便增加药效、选择性、作用持续时间以及降低毒性等。这时,为了平衡各种效应需 进行多位置变换。例如,如果变换参与同受体结合的某功能基也降低了化合物的亲脂性,以致 降低了穿越细胞壁和其他膜的能力,则可在分子的其他位置引入亲脂性基团以增加吸收。但是 在什么位置进行生物电子等排的变换呢?药效团的研究(见2.2.1)可以确定先导物中那些对 受体结合没有影响的基团,这些基团就可以变换(剪切不影响活性变化),可以对该处放心地 进行修饰。但是,这样的变换若改变分子的整体形状,会产生其他的活性 2.2.5.5组合化学 (1)一般概念组合化学( combinatorial chemistry)是为了通过生物筛选发现或优化先 导物而合成或生物合成的化学库,化学库是具有某种基本化学结构的化合物族[62]。典型的化 学库制备方法是,以系统的和重复的方式将组建模块( building blocks)通过共价键连接起来 的分子群。所谓组建模块是构建全部化合物结构的各种反应物分子。化学库包含有共同骨架的 多样性分子,所谓骨架系指化学库中的母体结构。该方法学的优点是在固体(聚合物)支持剂 上发生反应,每个反应产物的分离和纯化经简单的过滤和洗涤(用各种溶剂)连接有组建模块 的支持剂。由于聚合物的不溶解性,未与它结合的所有物质都可被除去,因而可用过量的试剂 以驱动合成反应。该方法的缺点是难以放大反应,并且反应单调。另一种策略是共价捕获技术 ( covalent scavenger technology),是用过量的试剂在溶液中进行反应,反应完成后用聚合物连 接的捕获剂将过量试剂去掉(图24)。这个方法将连接于捕获聚合物上的过量试剂经过滤除 去,反应产物留在溶液中63]。还有一种方法是用聚合物连接的试剂与溶液反应。为了避免异 种聚合物反应,用可溶性聚乙二醇作聚合物0 各种组合方法之间的主要区别是使用不同的固体支持剂、组装组建模块的方法、反应状态
24第2章药物的发现、设计与 R-NH2+RC—Cl R'+R-C一C RN-b-+1-N-R● R-NH+R一C一C1 +R一Nl2 hcl 过量 每N=C=0 R一NH-C-R+● 图24用连接于聚合物的试剂捕获过量的反应物 固相或溶液中)、被筛选库的数量(在总库中占的比例或单个化合物数)以及确定有效化合物 结构的方式等 组合库中化合物的数目(N)是由每一步反应用的组建模块数(b)和合成反应步数(x) 决定。如果每一步用的组建模块数相同,则按式(2-1)计算;若每步反应用的模块数不同,按 照式(2-2)计算(例如b,c和d是三步反应的组建模块)。 (2-1) N=bcd (2-2) 由20个氨基酸构成的五肽组合库中,共有N=205或320000个五肽。组合化学通常用 于制备肽库,但现在常用于合成非肽类的小分子化合物库。由于发现并发展了高通量筛选技 术,组合化学才得以蓬勃发展。若在短时间内没有检测这三百万个化合物的方法,那么制备这 么多就没有意义了。根据理论估算,相对分子质量低于800的类药性分子可高达10个,这 超过了宇宙的质量。若再低估为106个分子[65,即使一天合成一百万个化合物也要用10年 的时间0!因此,对于可能合成的化合物总数而言,即使用组合的方法也是不可能的。不过 用组合化学的方法还是比常规的合成方法快。然而,组合化学的分子多样性却不能与常规合成 的方法相比。最早用组合化学方法进行肽合成的有 Fural1, Geysen及其合作者8l和 Houghten10,继之 Zuckermann等合成了肽库, Ellman1和 Terrett及他们的合作者21 合成了非肽类的小分子库。 (2)混-分合成:肽库最初的方法称作分离合成法(又称混分法),是发现先导物最常 用的制备大容量库(10~10个化合物)的方法,也可称为筛选混合物库7)。分离合成得到 的产物是许多聚合物的小珠,每个珠上含有一个化合物,即一珠一个化合物。库中所有的组建 模块有各种可能的组合。混分合成法的严重缺陷是只能用于可序列合成的寡聚物,每个珠上 只能携带大约100~00pmol产物,这很难或不可能确定其结构。虽然简单的化合物可用质谱 法测定1,但若库中含有成千上万个化合物,且又不纯或化合物之间为异构体时,就不能用 本方法了,这时须用编码的方法(见下节 下面的实例说明如何用混分法进行合成,该方法是由三种氨基酸合成所有可能的三肽小
22先导化合物的修饰:药物设计与研发25 库(27个化合物),并可推延到任何容量的库。由His、Vl和Ser在 merrifield树脂上合成所 有可能的三肽(3=27),得到的是均相混合物库,过程如流程图2.2所示。要注意的是, Merrifield合成由C端开始,结束于N端。混合步骤非常重要,以确保每个容器中结合于树脂 上的化合物都是相同的混合物 Merrifield 合井均混和等分即混-分法)成3份,然后去保护基 酸用偶联试剂H 合井均混和等分成3份然后去保护基 HHH HHH 9个三肽库9个三肽库 个三肽库 均混然后从固相支持剂上裂解得到由27个 流程图2.2用固相法合成组、缬、丝氨酸组成 所有可能的三肽组合库 若想确定其中哪个肽与特定的受体结合最强呢? Houghten和其合作者制备了库容量为 5200万个L「71和D六肽7,寻找对阿片受体(吗啡和内啡肽的受体)的最佳拮抗剂,按 照流程图22合成。开始时用20个容器,用含有甲基二苯甲基胺(MBHA)的聚苯乙烯树 脂。由于用这种树脂切割下的寡肽为肽酰胺,在MBHA树脂上构建含有常用的20个氨基酸 的五肽库,混匀后分到20个容器中,每个容器中加入不同的N乙酰氨基酸,这样,在每个容 器中所有可能连接于树脂的N乙酰六肽,都有相同的N端;在每个容器中含有由不同的N端 氨基酸开始的所有N乙酰六肽[图25(a)]。例如,第一个容器中含有所有与树脂连接的N 乙酰六肽,在N端为N乙酰两氨酸(这种树脂与 Merrifield合成法相同,是从C端向N端构 建肽链)。第二个容器中含有所有与树脂连接的N乙酰六肽,始自N乙酰半胱氨酸等。全部 N乙酰六肽从树脂上裂解下来的是N乙酰六肽酰胺。测定20个容器中每个等分液的活性
26第2章药物的发现、设计与开发 活性最强的等分液提示,在N端的哪个氨基酸最好(本试验发现最佳的氨基酸为N乙酰精 酸)。然后重复该过程,到下一个MBHA树脂结合的四肽库均分到20个容器中,每个容器在 下一个N端位置偶联不同的氨基酸,这样,每个容器的N端为N乙酰精氨酸,因为前一次试 验已经证明它是最佳的残基[图2.5(b)]。然后将每个容器中的等分液从树脂上切割下来,测 定活性,并确定活性最好的倒数第二个位置的氨基酸。重复该过程,直到有20个容器中每个 只含有一个N乙酰六肽,并且分析20个中活性最佳的肽。按照这个模式,直到发现了对阿片 受体措抗作用最强的六肽 Ac-Arg--Phe-Met-Trp-Met-Thr-NH2。整个过程历时两 个月,可以想象若一次合成一个化合物会需要多少时间 (a)1.NAc-Aa- XXXXX-N-MBHA树脂 H 2.N一Ac-Cy- XXXXX-N-MBHA树脂 每个容器含有3.2×W个MH4F 3.NAc-A- XXXXX-N-MBHA树脂在N端有同样的基酸 20. N-Ac-Thr-xXXX-N-MBHA树脂 (b)1.N-A-Arg-Aa- XXXX-N-MBHA树脂 2.N-A-Ag-Cy-xxXX-N-MBHA树脂 3.N-Ac一Ag-Arg- XXXX-N-MBHA树脂 20.N-Ac-Ang-Thr-xxxx一N一MBHA树脂 图2.5由常见的20个氨基酸构建N乙酰六肽的组合合成 这个方法看起来不太巧妙,其实并非如此。有时活性最强的等分液不如前一轮测定的活性 强,难道是前一轮测定的化合物会包括后一轮(以及以后)的全部肽吗?这种现象在同时测定 多组分化合物特别是肽类时是常发生的事。一种解释是肽肽相互作用。在下一轮的容器中含 有的化合物比前一轮的少,因而在后一轮中失去了必要的肽肽相互作用,很可能活性成分确 实是两个或多个相互作用的肽,其中一个在下一轮合成中被除去了。也许是因为随着肽化合物 数减少,活性肽的构象发生了改变。肽类通常不适于作药用,这将在2.2.5,7节讨论 (3)编码组合库在我们把注意力转向更重要的非肽类库之前,先考察另一种确定组合库 中最有效化合物的方法,该法与上述反复试验只剩下一个化合物的技术不同,是更加迅速地试 验组合库中的全部化合物,并直接确定其中的活性成分。如前所述,含有复杂分子的大容量库 是不可能确定活性组分的结构的,这时需用编码的方法【78,编码方法很像生物学中通常蛋白 质的序列标识。蛋白质未被测序,但编码蛋白质的基因要测序7]。虽然化合物的实际结构不 一定要直接解析出,但可以测定编码这些结构的某些标识分子0。Sti等81在用混分法时, 用了一个重要的方法,即将惟一排布和容易分析的化学情性小分子标记到每个树脂珠上。理想 的标识物必需能够耐受有机反应条件,不干扰筛选试验结果,编码大数量的化合物应清晰无 误,受试化合物与编码的标识物能够组装到非常小的体积中。Sill的方法是在混分法构建化 学库的每一步,将一组标识物连接到树脂珠上。该标识物记录了该步骤所用的组建模块。合成
22先导化合物的修饰:药物设计与研发27 终结后将标识物除去,并加以分析,解析出连接于珠上的化合物结构。流程图23表明,在聚 合物珠的1%位置上连接一个或多个容易裂解下来的标识分子(标识物x)(大约1pmol/珠), 这些标识物编码了组建模块1(BB1)。然后将另一个或多个可裂解的标识物(标识物Y)连接 到编码的组建模块2(BB2)上。以后是标识物Z编码BB3等。每个组建模块虽然可用不同的 标识物,但用标识物的混合物最有效率,因为N个不同的标识物可以代表2N个不同的合成步 骤,若只用10个标识物,可进行1024(20)次合成。 珠)柘物X 建模块1(珠 标物Y,(珠)BB 只占位置的→ 光裂解连接基 BBl-BB2-BB3 BB3 BB2标识物2(珠)~B1-一B2 标识物 标识物Z3标识物X 标识物Y 珠)八~BB-B2-B3+标识物X+标识物Y+标识物z电子获气相色谱 与持羹 流程图2.3用Stl编码方法在聚合物珠上构建组合肽库 标识物应为化学情性物质,并在飞摩尔量下分析是可靠的。2.44和245是两类标识物的 实例。30个2.44标识物可被光分解,40个2.45标识物可被氧化裂解(用硝酸铈铵)。所有的 标识物都有不同的保留时间,游离出的标识物用毛细管气相色谱分析,电子捕获检测。另一种 监测方法是用荧光HPLC和气相色谱质谱联用。 Q 易氧化的连接 用混-分法如何在大量的树脂珠中发现活性化合物呢?其中一种方法是将常用的染料经化 学键联于靶受体上8],在测定活性时,仍然连接在树脂上。如果某化合物结合于标记了染料 分子的受体上,则结合了化合物的树脂珠会显示出颜色,可用手工方法挑出带色的珠子并解析 结构。珠的颜色深浅程度表征了化合物与受体的结合强度