第2章药物的发现、设计与开发 下面举例进一步说明这个过程。用丝、亮、赖、异亮和谷氨酸构成的全部六肽的组合库, 共含有56或15625个六肽,在每一次合成中引人适当的标识物,为此,需要有6X3(3比特 二进制编码)即18个不同的标识分子。标识物1-3用于定义组建模块1,标识物4-6定义 第二个模块,标识物7-9定义第三个,标识物10-12定义第四个,标识物13-15定义第五 个,标识物16一18定义第六个模块。每个氨基酸模块指定为任一3-比特二进制编码,例如 00=sa,l10=Leu,011ly,100=e,10cGlu。如果用了1个标识分子,川二进制码 表示,若不用标识分子,编码为0。由于肽的合成通常从连接了C端氨基酸的树脂开始,向 后偶联到N端。标识物16-18编码了 基酸,标识物1-3为C端级基酸的编码。假定 检定岀一个有活性的树脂珠,希望知道该六肽的结构。为此,用光裂解或氧化方法(取决于连 接基的性质)将树脂上的标识物裂解下来,羧基用三甲基硅烷化以增加挥发性,进行电子捕获 气相色谱。在本实验中例如检测出标识物1、2、5、6、8、9、12、14和16。将标识物解码, 确定的六肽如图2.6所示 标识物标识物2标识物标识物6标识物8标识物9标识物12标识物14标物1 无标识物3无标识物4无标识物7无标识物10无标识物3无标羽1 100010-00-01-011-110 Te- Leu. Ser. Lys- lys. Cilu (构建肽库时初始赋予肽链以3比特二进制编码作标笠) 图26用St方法对连接于树脂珠上的寡肽的编码 另一种编码方法是将标识分子与受试化合物分开,即将受试化合物连接在树脂的外部,标 识分子连接在树脂的内部],以避免标识分子干扰受试物与靶标受体的结合。因而发明了一 种树脂珠,只有其表面暴露于有机溶剂中,在有机溶剂中含有可溶性的衍生化试剂,这样,在 外部构建非肽类受试化合物,而珠的内部水相中无衍生化试剂。编码分子为肽化合物,是在树 脂珠的内部水介质中合成的。当用比色法检测出有活性树脂珠后,用 Edmann隊解法或质 谱方法。测定珠的内部标识物肽的序列,该序列编码了在珠外部连接的受试化合物的结构 另外一些重要的分子标识物编码是用射频标识物[8和具有异常形状的聚合物基质编 码[3]。编码方法有朝一日可被质谱分析代替,例如用飞行时间二级电离质谱(TOF S)[0,以每秒大约10个树脂珠的速度,一次测定数百个珠子,但有时混合物的碎片会出 现问题,使分析复杂化。质谱的精确度大约为士0.01amu,由20个氨基酸构成的含有3.2 105个五肽的组合库,除了亮氨酸和异亮氨酸(有相同的相对分子质量)外的全部五肽都可被 分开。若用5N标记亮或异亮氨酸,所有的肽都可被区分开 ()非肽库在后面2257节将讨论到,肽不是非常有用的药物,尤其不适于口服用 药。按照上述合成肽库的同样方法,也可用来制备非肽库。然而肽与非肽化学之间有重要的区 别,即反应性能不同。在延长肱链时典型的肽偶联反应中,用碳二亚胺活化的N保护的所有 不同的氨基酸都有相同的反应性能,因此,用混分法很奏效。然而若用非氨基酸试剂,例如 不同酸的酰氯,其结构会影响与各种亲核试剂的反应速度。这会使混合物中有的成分发生了反 应,有的没有发生。所以设定的条件应确保每步反应都是完全的 多年来人们已经认识到,当同时筛选大量的非肽类似物时,会出现许多假阴性(有活性的 分子没有被筛出为苗头化合物,所谓苗头化合物,系指试验测定显示有初步活性水平的化合
2.2先导化合物的修饰:药物设计与研发29 物)和假阳性(无活性的化合物当成苗头化合物)。假阳性可能起因于受试样品中的杂质或者 是多种化合物形成复合物所致。研究假阳性化合物是浪费时间,但假阴性意味着漏筛了潜在的 药物(或至少是先导物)。为了避免这些问题,大的制药公司大都筛选单个化合物,因此需要 合成单个化合物而不是混合物。但无论如何,用固相支持剂可以快速和自动化地合成大量单 化合物。合成反应是在含有聚合物支持剂的微型管中制备单个化合物,这种方法称作平行合成 ( parallel synthesis),而不叫组合合成,因为合成库中的化合物时(容量为50~104个化合物 每个1~50mg)无需合并反应管。为提高化合物库的效率,选择优势结构作为骨架是一种策 略。另一种策略是基于受体结构中重要的识别区域设计骨架。化合物库应包含不同的组建模块 市场上可买到)以便有大量的多样性结构,也应包括尽量多的功能基,作为识别因素。然而, 分子的多样性是难以确定的,Dxon和Ⅴllar证明,一个蛋白质分子可以同多种结构不同的分 子结合,且结合的亲和力相似;然而,与这些化合物相似的类似物与该蛋白质的结合却很 弱{。用平行合成的方法制备的化合物要比传统方法多得多,而每个化合物的费用却低 得多2]。 含有优势结构苯并二氮的非肽类库,其合成方法见流程图2.403],苯并二氮草的第 个片断2.47没有直接与聚合物氨甲基聚苯乙烯(249)相连,而是与2.46发生 Mitsunobu偶 联反应(PPh2/偶氮二羧酸二乙酯,DEAD),生成2.48,如果2.47直接连于聚合物上,则聚 合物对该化学反应会产生位阻效应,即在钯存在下,酰氯与芳香性锡烃( aryl stannane)发生 Stil偶联反应,生成2.50。为了避免该反应的发生,要在聚合物上连接一个间隔基,使第 个反应试剂远离聚合物,就不会有空间位阻效应。化合物246作为间隔基,在合成结束后除 NHBpoc DEAD c=c-0 L. PddbayCHCI 2. CH-CITFA 251 2.R-x R Ra 流程图24固相合成优势结构的非肽库
30第2章药物的发现、设计与开发 去。该固相合成中可变的多样性因素有三个:R2、R2和R,用尽可能多样的酰氯进行 Still 偶联反应(变换R)。得到的各个产物可与相同的Fmoc保护的氨基酸酰氟进行下一步偶联反 应或者每个2.50产物用不同的Fmoc-保护的氨基酸酰氟处理,这样,引入了多种R2取代基。 乙酸可将251自动环合生成252。然后,各个2.52用碱和相同的卤代烷(RX)处理,或者 用不同的卤代烷处理,生成2.53库。裂解掉间隔基和聚合物树脂,得到苯并二氮草库 (254)。若Stl偶联反应用25个不同的酰氯,每个偶联产物用25个不同的Fmoc保护的氨 基酸酰氟处理,得到的产物再与25个不同的卤代烷反应,这样,只用了75个不同的组建模块 就生成了由25×25×25=15625个苯并二氮草构成的化合物库 虽然组合库或平行方法具有合成潜力,但天然产物的结构多样性比标准的组合化学更多。 天然产物库( dictionary natual products和生物活性天然产物数据库( bioactive natural products database)总共有10万多个化合物,其中4%的化学骨架尚未合成l。而且,具有 生物活性的天然产物通常具有类药性,即可以被机体吸收和代谢0然而,从自然界分离 化合物以及用组合方法制备化合物应是互相补充的。从天然的提取物中分离和鉴定活性物质通 常要耗费许多时间,但可获得更多的多样性分子06,而且有更多的机会筛选各种结构骨架 为了利用多样的结构骨架进行活性筛选,组合化学家常常不选择有相似结构的化合物,他们认 为相似的化合物有相似的生物活性。然而,生物活性的相似性未必非常大,业已证明,85%有 活性的化合物的结构具有相似性,但只有30%的化合物活性相似6。例如,4羟椹哌啶衍生 物是趋化因子受体CCR的弱结合剂,而只加入一个亚甲基,即成为强结合剂,这是由于 相似的化合物未必以相同的方式与靶受体结合 根据有苗头的天然产物构建化学库是一种有效的方法。例如, Nicolaou等根据2,2-二甲 基苯并吡喃是许多天然产物的骨架,用它作为优势结构发展了固相合成法,制备了类似天然产 物的大组合库8,流程图2.5是一般合成法。2,2-二甲基苯并吡喃骨架(2.57)的合成是由 原料邻异戊烯基酚(2.55)与聚乙烯苯溴化硒树脂反应,通过各种反应变换侧链,进一步增加 库容量(2.56),再经氧化/消去反应将终产物从聚合物上裂解,得到2.57,该法得到的化学 库中含有一万多个类似 ●-sBr 取代基变换 流程图2.5固相法合成天然产物样的组合库 2.25.6核磁共振和质谱研究构效关系 雅培公司Feik等研究了一种利用核磁共振谱筛选小分子有机化合物库的方法,并用来确 定和优化对蛋白质有高亲和力的配体9(配体是与受体结合的化合物),这个方法称作核磁共 振研究构效关系( SaR by nmr),最初是用来发现对免疫抑制剂FK506结合蛋白呈纳摩尔
2.2先导化合物的修饰:药物设计与研发31 (nmol)亲和力的化合物,即将两个有微摩尔(mol)亲和力的分子(低活性)连接成一个分 子。该方法(图2.7)的第一步是筛选小分子化合物库,一次筛选10个,观测异核单量子相 干(HSQC)谱中酰胺的N的化学位移。确定了先导物后,从它的类似化合物库中,筛选对 该位点有高亲和力的化合物。然后筛选第二个化合物库,用以发现能够结合邻近位点的化合 物,并且筛选与该化合物相关的化合物库,优化其结构。基于蛋白质与两个结合配体的三元复 合物NMR谱,确定出这些配体的位置和取向,将这两个配体用共价键连接合成化合物。虽然 毎单个配体的结合性能比较弱,但两个配体共价连接后,亲和力明显增高,这是因为结合的自 由能是两个配体和连接基三个结合能之总和,结合的亲和力是三个亲和力之乘积。由于一个旋 转键被固定,会使结合的亲和力增加大约100倍,因此没有必要过多地优化先导物,因为即便 配体的亲和力是微摩尔甚至是亳摩尔级,将两个配体连结后均可达到纳摩尔水平 选第一配体 c/沈化第一配体 峁选第二配体 优化第二配体 连接两个配 图2.7核磁共振研究构效关系的方法 例如,利用该方法发现了基质降解酶的第一个抑制剂,该抑制剂成为潜在的抗肿瘤药 物1011。基质降解酶( stromelysin)是一种基质金属蛋白酶,属于含锌的水解酶,其功能是参 与正常组织重构,当许多疾病如关节炎、骨质疏松和癌症发生时100,可以降解细胞外的基质 成分如胶原和黏多糖( proteoglycan)。基质金属蛋白酶通常可被含有羟肟酸片断的化合物抑 制,羟肟酸与酶中的锌离子结合。经筛选羟肟酸化合物库,发现乙酰羟肟酸(2.58)的Kd为 17mmol/1,有很弱的结合力。在有饱和量(过量)乙酰羟肟酸的存在下,有目标地筛选疏水 性化合物,发现了联苯类化合物,经优化得到2.59,Kd为20mol/L。由核磁共振谱得知, 连接基的最佳位置是在乙酰羟肟酸的甲基和2.59的羟基处,因而通过改变连接基烷基链的长 度,最佳的连接基为1个碳原子,2.60的Kd值为15nmol/L。2.59的△G为-2.4kcal mo-10,化合物2,60的△G为-4,8kcal·mol-1,连接基的△G为-2,6kcal·mol-1,因此 总的能量变化为-9.8kcal·mol-1。发现这个化合物只用了6个月时间,而在此之前筛选了 115000个化合物都没有得到先导物。 听起来很简单,实际操作真是这样吗?下面讨论该方法涉及的内容。该方法需要筛选化合 1cal=4.2J—译者注
32第2章药的发现、设计与开发 物,还要观测酰胺的N的化学位移。15N从何而来?天然蛋白质的N丰度低,因而检测的浓 度不够高,这需要将1N掺入到蛋白质中。为了掺人1N,还要在微生物中能够表达出毫克级 的蛋白质。在含有惟一的氮源NH4Cl培养基中培养微生物,这样生成的蛋质都是含有5N 标记的氨基酸。进行NMR实验,需要有大量的可溶性蛋白(>100gmol/L,每个实验>200 mg),因此需要有高效率的蛋白质表达系统。蛋白质还需要纯化,并用三维和四维NMR技术 自定蛋白质的完全结构,这样就知道每个氮基酸在蛋白质中的位置,这对于确定两个在相近的 位置结合的配体是必需的。这些条件要求蛋白质靶标的分子质量不得大于40kDn(40kDm是 现行快速测定蛋白质NMR谱的限度,当然更大的蛋白质也可测谱)l。这个方法虽然是很 专业的技术,但还是得到了广泛的应用,这是由于分子生物学和蛋白质化学的进展,在微生物 中表达蛋白质,纯化蛋白质已是常规技术03]。新的NMR仪器和方法也有可能测定蛋白质结 构。用核磁共振研究构效关系的方法每天可自动筛选1000个化合物,并快速地确定蛋白质的 强效结合剂[,甚至共价结合剂也可以用高通量NMR筛选法确定l。在新药研制中,发 现微摩尔水平的蛋白质结合剂并不难,但花费时间的步骤是将先导物的活性提高到纳摩尔水 平,核磁共振研究构效关系则可缩短这一时间。 Ellman等应用核磁共振研究构效关系的基本原理研制出先导物优化的组合方法,不仅不 用NMR,还无需靶蛋白的任何结构或机理的信息103该方法是首先合成出多样性的化合物 库,使所有分子都含有一个共同的化学键连的基团(图2.8);其次,是筛选该化合物库,确 定对该靶标有(哪怕是微弱的)活性的所有化合物;再次,构建新的化合物库,用普通的有柔 性的化学键,将所有有活性的化合物连接成新的化合物;最后,筛选该组合库,确定活性最强 的类似物。该方法的特点是取决于两个化合物结合位置的邻近程度(虽然尚不知道哪两个化合 物结合以及结合的位置如何)以及组合时连接基的大小。这样连接成的活性化合物利用了三个 因素(两个化合物和一个连接基)的加和,获得了额外的自由能。该方法用于酪氨酸激酶的 种亚型的选择性抑制剂的研究,得到的活性强度为IC0=64nmol/L。 质谐研究构效关系( SaR by Ms)是与核磁共振研究构效关系互补的方法1。这是一种 高通量的基于质谱的筛选方法,可以定量研究亲和力,研究化学计量性以及大范围的测定特异 性配体的结合能。用质谱方法筛选一组结构多样的化合物,可确定出与受体结合的化合物,竞 争性实验可用来确定哪些化合物结合于相同的位点,哪些化合物不结合。如果两个化合物结合 于不同的结合位点,则会在质谱图上检测出由两个分子和受体组成的三元复合物。如果两个化 合物结合于相同的位点,紧密结合的分子会将在该位点上结合的其他分子置换下来,因而只能 检测出二元复合物。在不同的化合物系列中,通过变换取代基的大小再筛选,就可能确定出那 些在邻近位置结合的化合物,因为某一较大的基团加到一个分子上时,会使该分子变成亮争性 结合剂。一旦知晓了邻近结合位置,就可用核磁共振研究构效关系的方法,将两个化合用连接 基连接成一个分子。这个方法已用于发现以RNA为靶标的先导物,因为用常规的高通量筛选 方法尚不能确定RNA的抑制剂[10 2.2.5.7肽模拟物 在225.5节叙述了合成肽库的组合化学方法,肽类是非常重要的内源性分子,其功能是 作为神经递质、激素和神经调节剂等与各种受体结合,许多酶参与了这些肽的生物合成和 代谢。植物和动物以及人体的皮肤1含有多种肽类抗生物质。内源性肽也有镇痛12、 降压131和抗癌141的功效。然而,肽类不是良好的药物候选物,因为它们会在胃肠道和血清 中迅速水解,生物利用度低,排泄迅速,并能与多种受体结合。人们所需要的化合物是能够模 拟或阻断脉的生物效应,并与受体或酶发生相互作用,但应消除肽类不利的药代动力学性质, 这就是肽模拟物( peptidomimetics) 在本章的221节曾讨论了吗啡及其类似物(2.21)是阿片μ受体的强效结合剂