文稿电子版规格:A4页面以及后面具体要求 阿宽蕉根际土壤放线菌的分离与初步鉴定 徐虹燕1,吴春 (1北京理工大学生命学院,北京100081: 2.琼州学院生物科学与技术学院,海南三亚572022) 摘要:利用PCR从 Pseudomonas fluorescens B-8总DNA中成功扩增到编码PPLB的全长基 因,并进行测序通过生物信息学分析可知PPLB基因全长1272bp,编码423个氨基酸理论分子量为 458kDa等电点为553,在N末端有一个包含23个氨基酸的信号肽进化树及序列分析结果显示p/pb 是PLBs新基因家族的成员采用模建软件 Modeller进行人工建模结果表明 PI-PLB为由14股 Strand 组成的β-桶状蛋白,本研究为PPLB进一步高效表达及其脱胶机理研究奠定基础 关键词:氮杂冠醚;烟酸:晶体结构 中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号: 0引言 磷脂酶( Phospholipase)是一类能水解磷脂酯键的水解酶,具有细胞膜磷脂代谢、细胞周 期进程、信号转导、生物体内脂肪的消化及植物油脂脱胶等生物学活性,因而可广泛应用于 油脂精练、磷脂改性、饲料添加剂、医药等诸多方面口-磷脂酶依据其作用位点,可分为磷脂 酶A1、A2、B、C和D其中磷脂酶B( Phospholipase B,EC3.1.15)能同时水解磷脂Sn-1 和Sn-2位酰基,且具有溶血磷脂酶和转酰基酶的性质由于其底物特异性较广,在食品业和制 药业中磷脂衍生物的生成,以及植物油酶法脱胶中都有广泛的应用.目前已报道在细菌、真 菌、小鼠、人表皮细胞中都存在着磷脂酶B47 1材料与方法 11菌株与质粒 收稿日期:201402-09 基金项目:海南省自然基金项目(313049) 作者简介:徐虹燕(1984—),女,浙江温州人,琼州学院生物科学与技术学院讲师博士,主要研究方向为环境化学与生
1 文稿电子版规格:A4 页面以及后面具体要求 阿宽蕉根际土壤放线菌的分离与初步鉴定 徐虹燕1,2 , 吴 春1 （1.北京理工大学 生命学院，北京 100081； 2.琼州学院 生物科学与技术学院，海南 三亚 572022） 摘要：利用 PCR 从 Pseudomonas fluorescens BIT-18 总 DNA 中成功扩增到编码 Pf-PLB 的全长基 因,并进行测序.通过生物信息学分析,可知 Pf-PLB 基因全长 1272 bp,编码 423 个氨基酸,理论分子量为 45.8 kDa,等电点为 5.53,在 N 末端有一个包含 23 个氨基酸的信号肽.进化树及序列分析结果显示,pfplb 是 PLBs 新基因家族的成员.采用模建软件 Modeller 进行人工建模,结果表明 Pf-PLB 为由 14 股 Strand 组成的 β-桶状蛋白,本研究为 Pf-PLB 进一步高效表达及其脱胶机理研究奠定基础. 关键词：氮杂冠醚；烟酸；晶体结构 中图分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号： 0 引 言 磷脂酶（Phospholipase）是一类能水解磷脂酯键的水解酶,具有细胞膜磷脂代谢、细胞周 期进程、信号转导、生物体内脂肪的消化及植物油脂脱胶等生物学活性,因而可广泛应用于 油脂精练、磷脂改性、饲料添加剂、医药等诸多方面[1-2] .磷脂酶依据其作用位点,可分为磷脂 酶 A1、A2、B、C 和 D[3] .其中,磷脂酶 B（Phospholipase B,EC 3.1.15）能同时水解磷脂 Sn-1 和 Sn-2 位酰基,且具有溶血磷脂酶和转酰基酶的性质.由于其底物特异性较广,在食品业和制 药业中磷脂衍生物的生成,以及植物油酶法脱胶中都有广泛的应用.目前已报道,在细菌、真 菌、小鼠、人表皮细胞中都存在着磷脂酶 B [4-7] . 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒 收稿日期：2014-02-09 基金项目：海南省自然基金项目（313049） 作者简介：徐虹燕（1984—），女,浙江温州人,琼州学院生物科学与技术学院讲师,博士，主要研究方向为环境化学与生 态学
P. fluorescens BIT-18为本实验室保藏、,E. coli Top10、E. coli BL21(DE3)和pMD19-T购 于 Novagen公司pET28a(+)购于 TaKaRa公司 12试剂 PCR相关试剂如r-7 aq dna聚合酶等购自大连宝生物工程有限公司;PCR产物纯化、酶 切产物纯化和质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司:T4连接酶及限制性内切 酶包括 ECOR I、 Hind ll等购自 TaKaRa公司 2结果与讨论 21 P -PLB基因保守片段的克隆 以菌株P∫ crescens Bll-18总DNA为模板,采用引物Pl-F和Pl-R进行PPLB基因保守序 列PCR扩增,结果如图1所示从图中可以看出大小为500bp左右只在Lane2(P1-F和P-R双引 物扩增)中出现而在单引物扩增的Lane1、3不存在,说明该条带为双引物扩增所产生 M123 2000 250 图1 PE-PLB基因保守片段单引物PCR电泳图 (注: Lane m;DL2000 Marker; Lane 1;单引物P1-FPCR产物;Lane2:双引物P1-F和Pl-R PCR产物;Lane3:单引物P1RPCR产物) 图2PPLB的 Modeller棋拟 a.侧视图;b.仰视图 22化合物的结构描述
2 P. fluorescens BIT-18为本实验室保藏,E. coli Top 10、E. coli BL21 (DE3) 和 pMD19-T购 于Novagen公司.pET-28a(+)购于TaKaRa公司. 1.2 试剂 PCR相关试剂如r-Taq DNA聚合酶等购自大连宝生物工程有限公司；PCR产物纯化、酶 切产物纯化和质粒提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；T4连接酶及限制性内切 酶,包括EcoR I、Hind III等购自TaKaRa公司. 2 结果与讨论 2.1 Pf-PLB基因保守片段的克隆 以菌株P. fluorescens BIT-18总DNA为模板,采用引物P1-F和P1-R,进行Pf-PLB基因保守序 列PCR扩增,结果如图1所示.从图中可以看出大小为500 bp左右只在Lane 2（P1-F和P1-R双引 物扩增）中出现,而在单引物扩增的Lane 1、3不存在,说明该条带为双引物扩增所产生. M 1 2 3 图 1 Pf-PLB 基因保守片段单引物 PCR 电泳图 （注：Lane M：DL2000 Marker；Lane 1：单引物 P1-F PCR 产物；Lane 2：双引物 P1-F 和 P1-R PCR 产物；Lane 3：单引物 P1-R PCR 产物） 图 2 Pf-PLB 的 Modeller 模拟 a. 侧视图；b. 仰视图 2.2 化合物的结构描述 2000 1000 750 250 100 500 a b
由于多个配位水和游离水分子的存在,使结构中含有多个氢键这些氢键使整个配合物具 有稳定的结构,氢键数据见表1.其中的4个水分子通过氢键连接形成一个四核的水簇所形 成的OW…OW之间的平均距离为27AOW只是作为氢的给体而O3W既作为氢的给体又 作为氢的受体,OW和O8W则只作为氢的受体 表1化合物中的氢键键长和键角/(°) DH…·A d (D-H) d(H…A) d(D…A) ∠(DHA) OlW-HIWA…04W 850(4) 1.91(4) 2.716(7) 157(7) OW-HWB……N6 860(5) 2.22(4) 001(7) 151(4) O2W-H2WA…O7W0.847(18) 2.12(4) 2.791(13) 136(6) O2W-H2WA…O8W0.847(18) 238(5) 2925(19) 123(5) O2W-H2WB…O3W#10.840(4) 1.96(5) 2.763(6) 159(5) O3w-H2WB…O5#20.850(5) 2.06(5) 2.908(7) 173(5) Symmetry transformations used to generate equivalent atoms: #1: -x, -y, l-Z: #2: I-X, 1-y, 1-z. 参考文献:(录入格式请参看下面样式说明) 1 De Maria L, Vind J, Patkar S, et al. Phospholipases and their industrial applications []. Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 74(2 ): 290-300 [2]姜芳燕,产磷脂酶菌株的筛选鉴定及其应用门化工学报,2012,63(3):887-893. 3 Hearn EM, Patel DR, Lepore Bw, et al. Transmembrane passage of hydrophobic compounds through a protein channel wall []. Nature, 2009, 458: 367-370 [4]梁成伟,程江峰,王帅,等八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因分子进化特征青岛科技大学学报 (自然科学版),2009(5):408-411 [5]万哲先.代数导引[M].北京:科学出版社,2004 阿6]国家质量技术监督局海洋监测规范GB173784-2007S]北京:中国标准出版社,2008 [冂]中国互联网络信息中心.第14次中国互联网络发展状况统计报告[ROL].北京:中国互联网络信息中 心(2004-05-01)[2006-12-15.http://www.cnnicnetcn/download/2004/2004072002 Cloning and Bioinformatics Analysis of Phospholipase b
3 由于多个配位水和游离水分子的存在,使结构中含有多个氢键,这些氢键使整个配合物具 有稳定的结构,氢键数据见表 1. 其中的 4 个水分子通过氢键连接形成一个四核的水簇,所形 成的 OW∙∙∙OW 之间的平均距离为 2.7Å.O2W 只是作为氢的给体,而 O3W 既作为氢的给体又 作为氢的受体,O7W 和 O8W 则只作为氢的受体. 表 1 化合物中的氢键键长/Å 和键角/（º） D—H…A d（D—H） d（H…A） d（D…A） ∠（DHA） O1W—H1WA…O4W 0.850(4) 1.91(4) 2.716(7) 157(7) O1W—H1WB…N6 0.860(5) 2.22(4) 3.001(7) 151(4) O2W—H2WA…O7W 0.847(18) 2.12(4) 2.791(13) 136(6) O2W—H2WA…O8W 0.847(18) 2.38(5) 2.925(19) 123(5) O2W—H2WB…O3W#1 0.840 (4) 1.96(5) 2.763(6) 159(5) O3W—H2WB…O5#2 0.850(5) 2.06(5) 2.908(7) 173(5) Symmetry transformateions used to generate equivalent atoms :#1：-x,-y,1-z；#2：1-x,1-y,1-z. 参考文献 :（录入格式请参看下面样式说明） [1] De Maria L, Vind J, Patkar S, et al. Phospholipases and their industrial applications [J]. Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 74(2): 290-300. [2] 姜芳燕.产磷脂酶菌株的筛选鉴定及其应用[J].化工学报, 2012, 63(3): 887-893. [3] Hearn EM, Patel DR, Lepore BW, et al. Transmembrane passage of hydrophobic compounds through a protein channel wall [J]. Nature, 2009,458: 367-370. [4] 梁成伟, 程江峰, 王帅, 等.八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因分子进化特征[J].青岛科技大学学报 (自然科学版), 2009(5): 408-411. [5]万哲先.代数导引[M].北京:科学出版社,2004 [6]国家质量技术监督局.海洋监测规范:GB 17378.4-2007 [S]. 北京: 中国标准出版社, 2008. [7]中国 互联 网络 信息 中心 .第14次中 国互 联网 络发 展状 况统 计报 告[R/OL].北 京:中国 互联 网络 信息中 心.(2004-05-01)[2006-12-15]. http://www.cnnic.net.cn/download/2004/2004072002 Cloning and Bioinformatics Analysis of Phospholipase B
Gene from Pseudomonas fluorescens BlT-18 JIANG Fang-yan, HUANG Shen, LI Chun' (School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China; 2School of Biological Science and Technology, Qiongzhou University, Sanya Hainan, 572022 China Abstract: a gene from Pseudomonas fluorescens BIT-18 encoding a protein with phospholipase B activity(Pf-PLB) was cloned and sequenced. The bioinformatics analysis results showed that Pf-PLB containing an open reading frame 1272 bp in length. The cloned gene was predicted to encode a protein of 423 amino acid residues with a theoretical molecular mass of 45.8 kDa and a deduced pl of 5.53. According to the signal peptide prediction by the SignalP, a putative signal peptide cleavage site was situated at 23 amino acids after the initiation codon. Phylogenetic and sequence analy sis revealed that pfplb is a member of a new gene family of PLBs. The homology modeling by Modeller exhibited that Pf-PLB was a B-barrel protein which consisted of 14 strands. This research laid the foundations for the development of more effective expression systems and the degumming mechanism of Pf-PLB Keywords: aza-crown ether, nicotinic acid; crystal structure 参考文献录入示样: 1期刊论文J 5] De Maria L, Vind J, Patkar S, et al. Phospholipases and their industrial applications [J]Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 74(2): 290-300 6]姜芳燕产磷脂酶菌株的筛选鉴定及其应用[化工学报,2012,63(3):887-893 [7 Hearn EM, Patel DR, Lepore Bw, et al. Transmembrane passage of hydrophobic compounds through a protein channel wall [] Nature, 2009, 458: 367-370 [8]梁成伟,程江峰,王帅,等八氢番茄红素脱氢酶(PDS)基因分子进化特征叩青岛科技大学学报(自然 科学版,2009(5):408-411 2专著: [6]万哲先代数导引[M].北京:科学出版社,2004 [7]海德格尔.在通向语言的途中[M].孙周兴,译.北京:商务印书馆,2005 3.论文集中析出文献:
4 Gene from Pseudomonas fluorescens BIT-18 JIANG Fang-yan1,2 , HUANG Shen1 , LI Chun1 ( 1School of Life Science, Beijing Institute of Technology, Beijing 100081, China; 2School of Biological Science and Technology, Qiongzhou University, Sanya Hainan, 572022, China) Abstract: A gene from Pseudomonas fluorescens BIT-18 encoding a protein with phospholipase B activity (Pf-PLB) was cloned and sequenced. The bioinformatics analysis results showed that Pf-PLB containing an open reading frame 1272 bp in length. The cloned gene was predicted to encode a protein of 423 amino acid residues with a theoretical molecular mass of 45.8 kDa and a deduced pI of 5.53. According to the signal peptide prediction by the SignalP, a putative signal peptide cleavage site was situated at 23 amino acids after the initiation codon. Phylogenetic and sequence analysis revealed that pfplb is a member of a new gene family of PLBs. The homology modeling by Modeller exhibited that Pf-PLB was a β-barrel protein which consisted of 14 strands. This research laid the foundations for the development of more effective expression systems and the degumming mechanism of Pf-PLB. Keywords：aza-crown ether; nicotinic acid; crystal structure 参考文献[录入示样]： 1.期刊论文[J] [5] De Maria L, Vind J, Patkar S, et al. Phospholipases and their industrial applications [J].Applied Microbiology Biotechnology, 2007, 74(2): 290-300. [6] 姜芳燕.产磷脂酶菌株的筛选鉴定及其应用[J].化工学报, 2012, 63(3): 887-893. [7] Hearn EM, Patel DR, Lepore BW, et al. Transmembrane passage of hydrophobic compounds through a protein channel wall [J]. Nature, 2009,458: 367-370. [8] 梁成伟, 程江峰, 王帅, 等.八氢番茄红素脱氢酶（PDS）基因分子进化特征[J]. 青岛科技大学学报(自然 科学版), 2009(5): 408-411. 2.专著: [6]万哲先.代数导引[M].北京:科学出版社,2004. [7]海德格尔.在通向语言的途中[M].孙周兴,译.北京:商务印书馆,2005. 3.论文集中析出文献:
[8]辛希孟.基于ERP的库存管理方案[C]∥/信息技术与信息服务国际研讨会论文集.北京:中国社会科学出 版社,1994:113-16 4.文献汇编 [9]韩吉人.关于职工继续教育的问题研究[G]/中国职工研究会.职工教育研究论文集,北京:人民教育出 版社,1985:90-99 5.标准 [10国家质量技术监督局.海洋监测规范GB173784-2007[S]北京:中国标准出版社,2008 [门国家质量技术监督局海洋调查规范GB/T12763-2007[S]北京:中国标准出版社,2008 6.学位论文 [12]张筑生微分半动力系统的不变集[D].北京:北京大学数学系数学研究所,1983 7.报纸文章 [13]丁文祥.数字革命与竞争国际化[N].中国青年报,2000-11-20(2) 8.电子文献 [14]中国互联网络信息中心.第14次中国互联网络发展状况统计报告[R/OL].北京:中国互联网络信息中 心(2004-05-01)[2006-12-15].http://www.cnnicnetcn/download/2004/2004072002 15]李伟.欧亚19国将投巨资激活古丝绸之路 Leb/ol].[2008-02-25].http://www.ccnt.gov.cn/xwzx/whbzhxw/t2008022251774.htm 9专利 [16]姜锡洲.一种温热外敷药制备方案:中国,881056073[P].1989-07-26. 10.公报 [三亚人民政府.2012年三亚海洋环境质量公报[Z]2013
5 [8]辛希孟.基于 ERP 的库存管理方案[C]//信息技术与信息服务国际研讨会论文集.北京:中国社会科学出 版社,1994:113-116. 4.文献汇编: [9]韩吉人. 关于职工继续教育的问题研究[G]//中国职工研究会.职工教育研究论文集.北京:人民教育出 版社,1985:90-99. 5.标准： [10]国家质量技术监督局. 海洋监测规范:GB 17378.4-2007 [S].北京: 中国标准出版社, 2008. [11]国家质量技术监督局.海洋调查规范:GB/T 12763-2007 [S].北京: 中国标准出版社, 2008. 6.学位论文 [12] 张筑生.微分半动力系统的不变集[D].北京:北京大学数学系数学研究所,1983. 7.报纸文章: [13]丁文祥.数字革命与竞争国际化[N].中国青年报,2000-11-20（2）. 8.电子文献: [14]中国互联网络信息中心.第 14 次中国互联网络发展状况统计报告[R/OL].北京:中国互联网络信息中 心.(2004-05-01)[2006-12-15]. http://www.cnnic.net.cn/download/2004/2004072002. [15]李伟. 欧亚 19 国将投巨资激活古丝绸之路 [EB/OL].[2008-02-25].http://www.ccnt.gov.cn/xwzx/whbzhxw/t20080222_51774.htm. 9 专利 [16] 姜锡洲.一种温热外敷药制备方案:中国,881056073[P].1989-07-26. 10.公报 [17]三亚人民政府. 2012 年三亚海洋环境质量公报[Z]. 2013