仪器 1.高效液相色谱仪( Waters2690型)带9%6型紫外线检测器 2超声波振荡器 3离心机(5000/min) 4.微孔过滤器(滤膜0.54m) 三、试剂 1.甲醇(色谱纯,含量>999%9) 2水(超纯水) 3褪黑素标准品(纯度999%以上) 4褪黑素标准溶液:准确称取10mg褪黑素标准品于10mL容量瓶中,用甲醇定容。然后放置超声波 振荡器中充分溶解,浓度为0oomg/mL。用移液管准确移取上述溶液5mL于10mL容量瓶,配制成浓度 为0.500mg/mL的标准液。采用相同步骤分别配制浓度为0.250、0.125、0063mg/mL的标准液 四、测定步骤 1样品处理 取一片样品(标示含1mg褪黑素),放入小乳钵中研磨成粉末状后倒入5mL离心管中,用甲醇冲洗乳钵 3次,倒入离心管中,并定容至刻度。混匀后放入超声波振荡器中萃取10min,然后离心lmin(5000min) 把上清液移至5mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度。混匀后经0.5μm徼滤膜加压过滤,滤液待上机测定。 2.色谱分离条件 色谱柱:Nova-PakC18柱39mm×l50mm 流动相:甲醇+水(1+1)。 波长:260nm 流速:1.0mL/min 进样量:10 3标准曲线的绘制,将配制成的褪黑素标准液(0.063、0.125、0.250、0.500、1.000mg/mL)依次进样 10μL,测定各浓度相应的峰面积值,绘制标准曲线。 回归方程:y=1.5351×106x-2.7416×102,r=0.9991。 线性范围:0.063~1.000mgmL 4样品测定 取样品处理液10μL注入高效液相色谱仪分离测定,以标准品峰的保留时间定性,并根据样品组分的 峰面积在标准曲线上査出相应组分含量 五、结果计算 V1×100 mxV2×100 式中X——褪黑素的含量(mg/100g) m——从标准曲线上查得相应的黑素的质量(g)
11 二、仪器 1.高效液相色谱仪(Waters2690 型)带 996 型紫外线检测器。 2.超声波振荡器 3.离心机(5000r/min)。 4.微孔过滤器（滤膜 0.5μm） 三、试剂 1.甲醇(色谱纯，含量>99.9%)。 2.水（超纯水） 3.褪黑素标准品(纯度 99.9％以上)。 4.褪黑素标准溶液：准确称取 10mg 褪黑素标准品于 10mL 容量瓶中，用甲醇定容。然后放置超声波 振荡器中充分溶解，浓度为 1.000mg/mL。用移液管准确移取上述溶液 5mL 于 10mL 容量瓶，配制成浓度 为 0.500mg/mL 的标准液。采用相同步骤分别配制浓度为 0.250、0.125、0.063mg/mL 的标准液。 四、测定步骤 1.样品处理 取一片样品(标示含 1mg 褪黑素)，放入小乳钵中研磨成粉末状后倒入 5mL 离心管中，用甲醇冲洗乳钵 3 次，倒入离心管中，并定容至刻度。混匀后放入超声波振荡器中萃取 10min，然后离心 10min(5000r/min)， 把上清液移至 5mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度。混匀后经 0.5μm 微滤膜加压过滤，滤液待上机测定。 2.色谱分离条件 色谱柱：Nova—PakC18 柱 3.9mm×l50mm。 流动相：甲醇+水（1+1）。 波 长：260nm 流 速：1.0mL/min 进 样 量：10μL 3.标准曲线的绘制，将配制成的褪黑素标准液（0.063、0.125、0.250、0.500、1.000mg/mL）依次进样 10μL，测定各浓度相应的峰面积值，绘制标准曲线。 回归方程：y=1.5351×10-6 x-2.7416×10-2 ，r=0.9991。 线性范围：0.063~1.000mg/mL 4.样品测定 取样品处理液 10μL 注入高效液相色谱仪分离测定，以标准品峰的保留时间定性，并根据样品组分的 峰面积在标准曲线上查出相应组分含量。 五、结果计算 X= 式中 X——褪黑素的含量（mg/100g）; m1——从标准曲线上查得相应的黑素的质量（μg）； m×V2×100 m1×V1×100
V1一样品定容总体积(L) V2—进样量(L) M—一样品质量(g) 第五节肉碱( L-Carnitine)的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用于添加左旋肉碱的功能性食品中肉碱的测定。 本方法肉碱最小检出量为1.82 方法提要 样品的水溶液用高效液相色谱法将左旋肉碱分离,经紫外检测器检测,测定出相应的峰面积,用外标 或内标法定量。 二、仪器 1.Bio-Rad700高效液相色谱仪,UV-1706紫外检测器。 2.超声波振荡器。 3微孔过滤器(滤膜0.45m)。 三、试剂 1.甲醇:色谱纯(浙江黄岩化工实验厂)。 2水:为三蒸水并经MlIQ超纯处理。 3离子对色谱试剂:IPR一B(庚烷磺酸钠·CrH1 sSO Na):天津市化学试剂二厂。 4磷酸(H3PO4):分析纯 5氢氧化钠(NaOH):分析纯 6左旋肉碱标准品:L-4—氨基一羟基丁酸(CnH1sNO3),由瑞士龙沙公司提供 7对氨基苯甲酸: C7H7NO2,分析纯:准确称取100mg对氨基苯甲酸用水溶解于100mL容量瓶中,加 水至刻度,配成Img/mL的内标溶液(样品用);此液用水稀释10倍为0.lmg/mL(标准用) 8标准溶液:准确称取25、50、75、100、125mg的左旋肉碱标准品溶于流动相中,用流动相稀释至 25mL刻度,配成每lm的内标溶液(样品用);此液用水稀释至25mL刻度,配成每1mL含1.0、2.0、3.0、 40、50mg左旋肉碱 内标法:同上,但内含0.1mg/M对氨基苯甲酸5mL(最终浓度=0.02mg/mL)。 四、测定步骤 1样品处理 (1)外标法 准确称取含左旋肉碱500mg左右的样品于50mL容量瓶中,加水约4mL,置超声振荡器中20min助 溶,冷却,用水稀释至放刻度,过滤,吸取5mL。滤液于25mL溶量瓶中,用流动相稀释至刻度,经0.45 μm滤膜过滤,滤液备用 (2)内标法 准确称取含左旋肉碱500mg左右的样品于50mL容量瓶中,加水约40mL,及5mL(1.0mg/mL)对氨基
12 V1——样品定容总体积（μL） V2——进样量（μL） M——样品质量（g） 第五节 肉碱（L——Carnitine）的测定方法（高效液相色谱法） 本方法适用于添加左旋肉碱的功能性食品中肉碱的测定。 本方法肉碱最小检出量为 1.82μg。 一、方法提要 样品的水溶液用高效液相色谱法将左旋肉碱分离，经紫外检测器检测，测定出相应的峰面积，用外标 或内标法定量。 二、仪器 1.Bio—Rad700 高效液相色谱仪，UV-1706 紫外检测器。 2.超声波振荡器。 3.微孔过滤器(滤膜 0.45μm)。 三、试剂 1.甲醇：色谱纯(浙江黄岩化工实验厂)。 2.水：为三蒸水并经 Milli—Q 超纯处理。 3.离子对色谱试剂：IPR—B7(庚烷磺酸钠·C7H15SO3Na)：天津市化学试剂二厂。 4.磷酸(H3PO4)：分析纯。 5.氢氧化钠(NaOH)：分析纯。 6.左旋肉碱标准品：L—4—氨基—羟基丁酸（C7H15NO3），由瑞士龙沙公司提供。 7.对氨基苯甲酸：C7H7NO2，分析纯：准确称取 100mg 对氨基苯甲酸用水溶解于 100mL 容量瓶中，加 水至刻度，配成 1mg/mL 的内标溶液（样品用）；此液用水稀释 10 倍为 0.1mg/mL(标准用)。 8.标准溶液：准确称取 25、50、75、100、125mg 的左旋肉碱标准品溶于流动相中，用流动相稀释至 25mL 刻度，配成每 1ml 的内标溶液（样品用）；此液用水稀释至 25mL 刻度，配成每 1mL 含 1.0、2.0、3.0、 4.0、5.0mg 左旋肉碱。 内标法：同上，但内含 0.1mg/mL 对氨基苯甲酸 5mL（最终浓度=0.02mg/mL）。 四、测定步骤 1.样品处理 （1）外标法 准确称取含左旋肉碱 500mg 左右的样品于 50mL 容量瓶中，加水约 40mL，置超声振荡器中 20min 助 溶，冷却，用水稀释至放刻度，过滤，吸取 5mL。滤液于 25mL 溶量瓶中，用流动相稀释至刻度，经 0.45 μm 滤膜过滤，滤液备用。 （2）内标法 准确称取含左旋肉碱 500mg 左右的样品于 50mL 容量瓶中，加水约 40mL，及 5mL (1.0mg/mL)对氨基
苯甲酸,置超声振荡器中同上处理。 2色谱分离条件 色谱柱:BIO- RAD BIO-SIL OBS。10250mm×4mms 流动相:吸取2.5mL磷酸于475mL水中,加入25 mLlmol/l naoh摇匀,调整pH2.4,再加入50mg 庚烷磺酸钠(B),溶解后加入260mL甲醇 紫外检测器检测波长:2|0nm 流速:1mL/min 灵敏度:0.00。 进样量:20L 3.标准曲线的绘制 分别准确吸取以上各种浓度的标准溶液和样品滤液20μL于HPLC中进行测定,记录各组分峰面积 以左旋肉碱的浓度为横坐标,左旋肉碱的峰面积(或与内标峰的面积比值)为纵坐标绘制标准曲线。 左旋肉碱浓度在1.0-50mg/mL线性良好、线性回归方程y=0.0086+0.1061x,相关系数r=0.999 4样品测定 准确吸取样品滤液20μL于HPLC中,并根据样品组分的峰面积(或与内标峰的面积比值)在标准 曲线上查出相应的左旋肉碱的含量 五、结果计算 m×1000 式中X—一左旋肉碱的百分含量(%) m-—在标准曲线上查出相应的左旋肉碱质量(mg) n一样品的稀释倍数: m——样品质量(g) 1000——mg换算成g 六、注释 1关于标准品 左旋肉碱①L- Carnitine)极易吸水变潮,故称量时要注意标准品是否干燥,如潮解不能烘干再用,亦可 选用左旋肉碱酒石酸盐(L- Carnitine tartrate)或消旋肉碱盐酸盐(DL- Carnitine hydrochloride)等作标准品, 但要注意换算:如从L- Carnitine tartrate换算为 L-Carnitine要乘系数0682,从L- Carnitine换算为L Carnitine tartrate要乘系数14655。用左旋肉碱酒石酸盐作标准品时,色谱图中在前面多出一个酒石酸盐的 色谱峰 2本法引自美国药典USP-NF1995(1),流动相只适用于含杂质较少的样品,如保健食品中配方复杂 并添加了中草药、维生素及其他赋形剂等,可将流动相用水或pH2.4的磷酸盐缓冲液稀释3-4倍并适当添 加离子对试剂的用量;如样品为口服液或饮料,流动相中水相(pH2.4的磷酸盐缓冲液)与甲醇的比例可延
13 苯甲酸，置超声振荡器中同上处理。 2.色谱分离条件 色谱柱：BIO-RAD BIO—SIL OBS。10 250mm×4mm。 流动相：吸取 2.5mL 磷酸于 475mL 水中，加入 25mLlmol/L NaOH 摇匀，调整 pH2.4，再加入 50mg 庚烷磺酸钠(B7)，溶解后加入 260mL 甲醇。 紫外检测器检测波长：2l0nm。 流 速：1mL/min 灵敏度 ：0.00l。 进样量 ：20μL 3.标准曲线的绘制 分别准确吸取以上各种浓度的标准溶液和样品滤液 20μL 于 HPLC 中进行测定，记录各组分峰面积， 以左旋肉碱的浓度为横坐标，左旋肉碱的峰面积（或与内标峰的面积比值）为纵坐标绘制标准曲线。 左旋肉碱浓度在 1.0~5.0mg/mL,线性良好、线性回归方程 y=-0.0086+0.1061x，相关系数 r=0.9997。 4.样品测定 准确吸取样品滤液 20μL 于 HPLC 中，并根据样品组分的峰面积（或与内标峰的面积比值）在标准 曲线上查出相应的左旋肉碱的含量。 五、结果计算 X= 式中 X——左旋肉碱的百分含量(％)； m1——在标准曲线上查出相应的左旋肉碱质量(mg)； n——样品的稀释倍数； m——样品质量（g）； 1000——mg 换算成 g。 六、注释 1.关于标准品 左旋肉碱(L—Carnitine)极易吸水变潮，故称量时要注意标准品是否干燥，如潮解不能烘干再用，亦可 选用左旋肉碱酒石酸盐(L—Carnitine tartrate)或消旋肉碱盐酸盐(DL—Carnitine hydrochloride)等作标准品， 但要注意换算：如从 L—Carnitine tartrate 换算为 L—Carnitine 要乘系数 0.682，从 L—Carnitine 换算为 L— Carnitine tartrate 要乘系数 1.4655。用左旋肉碱酒石酸盐作标准品时，色谱图中在前面多出一个酒石酸盐的 色谱峰。 2.本法引自美国药典 U.S.P—NF 1995（I），流动相只适用于含杂质较少的样品，如保健食品中配方复杂 并添加了中草药、维生素及其他赋形剂等，可将流动相用水或 pH2.4 的磷酸盐缓冲液稀释 3~4 倍并适当添 加离子对试剂的用量；如样品为口服液或饮料，流动相中水相（pH2.4 的磷酸盐缓冲液)与甲醇的比例可延 100 1000 1 m m n
至98:2,庚烷磺酸钠可加至55mg。 3左旋肉碱才具有生理活性.本法最大的缺点是不能将右旋和消旋的肉碱区分开。 第六节免疫球蛋白IgG的测定方法(单向免疫扩散法) 本方法适用于功能性食品中免疫球蛋白IgG的测定,其中1gG的最低检出限为20g/mL 、方法提要 在含有抗体的琼脂板的小孔中加入抗原溶液,经过扩散后,在小孔周围形成抗原体沉淀环,此沉淀环 面积与小孔中的抗原量成正比。测定样品中lgG时,琼脂板中可加入适量的免抗牛IgG抗血清,琼脂板各 小孔中分别是加入一系列的己知IgG含量的对照标准品及适量稀释的待测lgG乳粉样品,经过24h扩散后, 测量各沉淀环直径。以lgG标准品系列浓度为横坐标,沉淀环直径的平方为纵坐标绘制标准曲线,根据待 测lgG样品形成的沉淀环直径查标准曲线得到对应的IgG浓度即可计算其含量。 、仪器 1.琼脂模板 由二块75cm×18cm玻璃板中间隔放一块有机玻璃U形板(厚0.22cm,各边宽lcm,底边长18cm,底 边长18cm,两边长75cm)构成,用弹簧夹紧 2打孔器,Φ2.5mm 3.湿盒:有盖搪瓷盘,盘底铺垫纱布3~4层,用0.5%苯酚溶液浸湿纱布。 4微量进样器。 5水浴锅。 三、试剂 l.pH68磷酸盐缓冲液:称取分析纯的磷酸氢二钾68g和氢氧化钠θ.舛4g,加蒸馏水溶解并稀释至L 混匀 2.优质琼脂 3兔抗牛lgG抗血清(生化试剂):效价为1:32 4牛1gG对照标准品(生化试剂): Sigma公司提供 四、测定步骤 1.抗体琼脂板的制备 在pH6.8磷酸盐缓冲液中加入10%琼脂,加热溶化,冷却到55℃,并在55℃水浴中保温,然后加入 抗牛lgG抗血清(效价为1:32,添加量为体积的1/80),迅速混合后倒λ琼脂模板内。待琼脂凝固后(需 l0~15min),将上面的玻璃板小心取去,再取去U形板,用打孔器相隔1.5cm打孔一个,并挑出孔内琼脂 14
14 至 98：2，庚烷磺酸钠可加至 555mg。 3.左旋肉碱才具有生理活性．本法最大的缺点是不能将右旋和消旋的肉碱区分开。 第六节 免疫球蛋白 IgG 的测定方法（单向免疫扩散法） 本方法适用于功能性食品中免疫球蛋白 IgG 的测定，其中 IgG 的最低检出限为 20μg/mL。 一、方法提要 在含有抗体的琼脂板的小孔中加入抗原溶液，经过扩散后，在小孔周围形成抗原体沉淀环，此沉淀环 面积与小孔中的抗原量成正比。测定样品中 IgG 时，琼脂板中可加入适量的免抗牛 IgG 抗血清，琼脂板各 小孔中分别是加入一系列的己知 IgG 含量的对照标准品及适量稀释的待测 IgG 乳粉样品，经过 24h 扩散后， 测量各沉淀环直径。以 IgG 标准品系列浓度为横坐标，沉淀环直径的平方为纵坐标绘制标准曲线，根据待 测 IgG 样品形成的沉淀环直径查标准曲线得到对应的 IgG 浓度即可计算其含量。 二、仪器 1.琼脂模板 由二块 7.5cm×18cm 玻璃板中间隔放一块有机玻璃 U 形板(厚 0.22cm，各边宽 lcm，底边长 18cm，底 边长 18cm，两边长 7.5cm)构成，用弹簧夹紧。 2.打孔器，Ф 2.5mm。 3.湿盒：有盖搪瓷盘，盘底铺垫纱布 3~4 层，用 0.5%苯酚溶液浸湿纱布。 4.微量进样器。 5.水浴锅。 三、试剂 1.pH6.8 磷酸盐缓冲液：称取分析纯的磷酸氢二钾 6.8g 和氢氧化钠 0.94g，加蒸馏水溶解并稀释至 1L， 混匀。 2.优质琼脂。 3.兔抗牛 lgG 抗血清(生化试剂)：效价为 1:32。 4.牛 IgG 对照标准品（生化试剂）： Sigma 公司提供。 四、测定步骤 1.抗体琼脂板的制备 在 pH6.8 磷酸盐缓冲液中加入 1.0%琼脂，加热溶化，冷却到 55℃，并在 55℃水浴中保温，然后加入 抗牛 IgG 抗血清（效价为 1：32，添加量为体积的 1/80），迅速混合后倒入琼脂模板内。待琼脂凝固后（需 10~15min），将上面的玻璃板小心取去，再取去 U 形板，用打孔器相隔 1.5cm 打孔一个，并挑出孔内琼脂