定容至刻度,摇匀。(注:样品为经大孔吸附树脂吸附纯化并配合溶剂法提取制得的大豆总异黄酮提取纯 化物,浅黄棕色粉末,味苦) (2)标准曲线的绘制:准确吸取0.05、01、0.15、0.2、0.3、04mL标准品溶液分别置于10mL容量 瓶中,并各加95%乙醇1.0mL,再加蒸馏水稀释至刻度,摇匀。以lmL95%乙醇加水到10mL作空白对照, 在259mm处测得吸光度,以测得之吸光度与纯品量绘制标准曲线并得出回归方程见表28-1。 计算公式 回归方程y=ax+b相关系数r=0.996 式中b—一截距,0.2006; d一斜率,78118 表28-1标准曲线与回归方程 编号 2 4 5 6 0.52 1.04 1.56 2.08 3.12 4.16 0.0432 0.1080 0.1763 0.2735 0.3654 0.5131 (3)样品测定:分别准确吸取样品液0.3mL于3只10mL容量瓶中,以下按标准曲线制备项下操作 在259mm处测定吸收度,计算平均值,按标准曲线方程计算含量,并计算样品的大豆总异黄酮质量分数。 结果见表28 表28-2样品中的大豆总异黄酮含量 吸光度/OD 0.2837 0.2837 0.2795 平均吸光度/OD 0.2835 含量/(g/mL 8.0452 5.精密度实验 准确吸取标准品溶液0.2mL,分别置5只10mL容量瓶中,按标准曲线项下操作,测定吸收度,计算 相对标准差(RSD)为2.6%。 6.加样回收率实验 准确吸取1、0.2、0.2、0.2、0.lmL标准品溶液于5只lmL容量瓶中,再分别准确加入样品液0.3mL, 照标准曲线制备项下操作,计算加样回收率,结果见表28-3 表28-3加样回收率实验 平均RSD/ 加标准品质量/g 1.04 2.08 1.04 2.08 2.08 0.3mL样品中相当 2.41492.4149241492414924149 金雀黄素的量/g OD 值 0.36650.49650.49320.49880.3625
6 定容至刻度，摇匀。（注：样品为经大孔吸附树脂吸附纯化并配合溶剂法提取制得的大豆总异黄酮提取纯 化物，浅黄棕色粉末，味苦）。 （2）标准曲线的绘制：准确吸取 0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4mL 标准品溶液分别置于 10mL 容量 瓶中，并各加 95%乙醇 1.0mL，再加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。以 lmL95%乙醇加水到 l0mL 作空白对照， 在 259nm 处测得吸光度，以测得之吸光度与纯品量绘制标准曲线并得出回归方程见表 28—1。 计算公式： 回归方程 y = ax + b 相关系数 r = 0.9996 式中 b——截距，0.2006； d——斜率，7.8118。 表 28—1 标准曲线与回归方程 编号 1 2 3 4 5 6 x/μg 0.52 1.04 1.56 2.08 3.12 4.16 y 0.0432 0.1080 0.1763 0.2735 0.3654 0.5131 （3）样品测定：分别准确吸取样品液 0.3mL 于 3 只 10mL 容量瓶中，以下按标准曲线制备项下操作， 在 259nm 处测定吸收度，计算平均值，按标准曲线方程计算含量，并计算样品的大豆总异黄酮质量分数。 结果见表 28—2。 表 28—2 样品中的大豆总异黄酮含量 编号 1 2 3 吸光度/OD 0.2837 0.2837 0.2795 平均吸光度/OD 0.2835 含量/（μg/mL） 8.0452 5. 精密度实验 准确吸取标准品溶液 0.2mL，分别置 5 只 10mL 容量瓶中，按标准曲线项下操作，测定吸收度，计算 相对标准差（RSD）为 2.6%。 6. 加样回收率实验 准确吸取 0.1、0.2、0.2、0.2、0.1mL 标准品溶液于 5 只 l0mL 容量瓶中，再分别准确加入样品液 0.3mL， 照标准曲线制备项下操作，计算加样回收率，结果见表 28—3。 表 28—3 加样回收率实验 1 2 3 4 5 平均 RSD/% 加标准品质量/μg 1.04 2.08 1.04 2.08 2.08 0.3mL 样品中相当 金雀黄素的量/μg 2.4149 2.4149 2.4149 2.4149 2.4149 OD 值 0.3665 0.4965 0.4932 0.4988 0.3625
测得相当金雀 黄素的含量/ 3.46794.4921 4.46634.5046 4489 回收率/% 98.63 1004799.08 平均回收率/% 9986 1.06 7.结果计算 样品中大豆总异黄酮的百分含量(以金雀异黄素计算)按稀释度和金雀异黄素标准曲线的相应量计算 8.注释 若受试物为大豆的制品,如水豆腐、干豆腐、豆芽、豆豉等可采用食品粉碎机破碎后冷冻干燥,分别 取干重为l0g的受试样品置于锥形瓶中,加入石油醚50mL,放置24h,过滤,残渣用滤纸筒包好,置于水 浴上的索氏提取器中用甲醇提取6h,注意温度低于π0℃。提取液回收甲醇,残渣上大孔吸附树脂柱,用 水洗脱除去糖类成分,续以95%的乙醇洗脱,将乙醇洗脱液浓缩,干燥,以95%乙醇定容为25mL。豆浆、 豆汁等液体大豆饮品可在60℃水浴上蒸干,取干重为1啁g的干燥物与干燥后的水豆腐等一样处理,得到不 同的样品95%乙醇溶液 二、大豆异黄酮的测定方法(高效液相色谱法) 本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。 本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为10ng:大豆苷元的最低检出限为30ngo 1.方法提要 大豆异黄酮( soybean isoflavones,简称ISO)是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善 心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有12种,染 料本素( Genistein,G)和大豆苷元( Daidzein,D)是其中两种重要化合物。本法用80%乙醇作为溶剂, 提取样品中的染料木素、大豆苷元,以反相高效液相色谱分离,在紫外检测器260nm条件下检测其峰面积 以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。 2.仪器 (1)LC高效液相色谱仪,C—RIB色谱处理机 (2)检测器:SPD2AS紫外检测器。 (3)离心机。 (4)超声波振荡器。 3.试剂 (1)甲醇(色谱纯)。 (2)乙醇(优级纯)。 (3)双重蒸馏水 (4)大豆异黄酮标准品:染料木素与大豆苷元标准品(美国 Sigma公司产品),以染料木素的大豆苷 元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。 (5)大豆异黄酮标准溶液:准确称取染料木素标准品5.0mg,大豆苷元标准品3.2mg,各自用流动相
7 测得相当金雀 黄素的含量/μg 3.4679 4.4921 4.4663 4.5046 3.4489 回收率/% 101.25 99.87 98.63 100.47 99.08 平均回收率/% 99.86 1.06 7. 结果计算 样品中大豆总异黄酮的百分含量（以金雀异黄素计算）按稀释度和金雀异黄素标准曲线的相应量计算。 8. 注释 若受试物为大豆的制品，如水豆腐、干豆腐、豆芽、豆豉等可采用食品粉碎机破碎后冷冻干燥，分别 取干重为 l0g 的受试样品置于锥形瓶中，加入石油醚 50mL，放置 24h，过滤，残渣用滤纸筒包好，置于水 浴上的索氏提取器中用甲醇提取 6h，注意温度低于 70℃。提取液回收甲醇，残渣上大孔吸附树脂柱，用 水洗脱除去糖类成分，续以 95%的乙醇洗脱，将乙醇洗脱液浓缩，干燥，以 95%乙醇定容为 25mL。豆浆、 豆汁等液体大豆饮品可在 60℃水浴上蒸干，取干重为 10g 的干燥物与干燥后的水豆腐等一样处理，得到不 同的样品 95%乙醇溶液。 二、大豆异黄酮的测定方法（高效液相色谱法） 本方法适用于大豆制品中大豆异黄酮的测定。 本方法大豆异黄酮染料木素的最低检出限为 10ng；大豆苷元的最低检出限为 30ng。 1. 方法提要 大豆异黄酮（soybean isoflavones，简称 ISO）是一类从大豆中分离提取的具有抗氧化、抗肿瘤、改善 心血管功能的主要活性成分。目前发现的大豆异黄酮包括游离型苷元和结合型的糖苷两类共有 12 种，染 料本素（Genistein，G）和大豆苷元（Daidzeiu，D）是其中两种重要化合物。本法用 80%乙醇作为溶剂， 提取样品中的染料木素、大豆苷元，以反相高效液相色谱分离，在紫外检测器 260nm 条件下检测其峰面积， 以染料木素和大豆苷元两项含量之和计算大豆异黄酮含量。 2. 仪器 （1）LC 高效液相色谱仪，C—RIB 色谱处理机。 （2）检测器：SPD—2AS 紫外检测器。 （3）离心机。 （4）超声波振荡器。 3. 试剂 （1）甲醇（色谱纯）。 （2）乙醇（优级纯）。 （3）双重蒸馏水。 （4）大豆异黄酮标准品：染料木素与大豆苷元标准品（美国 Sigma 公司产品），以染料木素的大豆苷 元两项之和作为大豆异黄酮含量计算。 （5）大豆异黄酮标准溶液：准确称取染料木素标准品 5.0mg，大豆苷元标准品 3.2mg，各自用流动相
“甲醇+水(60+40)”定容至100mL,配制成50HgmL的染料木素和32μg/mL的大豆苷元标准溶液 4.测定步骤 (1)样品处理 a.固体样品:准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中,定量加入80%乙醇,经超声振荡5min, 加水补足至刻度,待提取液略澄清后经离心分离(3000r/min,5min),取上清液经045μm滤膜过滤后待 进样 b.液体样品:准确吸取2·0mL液体样品,加入80%乙醇摇匀并定容100mL,澄清后同上述步骤 (2)色谱分离条件 色谱柱:Shim- Pack clc-ODS,6mmx150mm,5m。 流动相:甲醇+水(60+40),临用前用超声波除气 流速:0~5min,为10mL/min:5~10min为16 mL/min。 柱温:40℃。 检测波长:UV260nm 灵敏度:0.016AUFS 进样量:104L (3)样品测定:准确称取样品处理液和标准液各10μL(或相同体积)注入高效液相色谱仪进行分 离,以其标准溶液峰的保留时间进行定性,利用峰面积求出样液中待测物质的含量。 5.结果计算 S. xm 式中X一样品中染料木素大豆苷元的含量(ug/g); S1-一样品峰面积 c——标准溶液浓度(μg/mL); S2-一标准溶液峰面积 —一样品定容体积(mL) m试样质量(g)。 样品中大豆异黄酮含量X(gg)=X+XXg、X分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量) 6.注释 (1)本法染料木素浓度在001~0.1mg/mL范围内呈直线关系,相关系数为0.9968大豆苷元浓度在 0.003~0.03mg/mL范围内呈直线关系,相关系数09945 (2)精密度:同一样品依本法重复6次,染料木素、大豆苷元的相对标准差(RSD)分别为3.1%及 (3)回收率:依本法各取试样9份,每3份为一组,分别加入不同量标准品进行试样处理,染料木 素添加回收率为950%~1037%、大豆苷元添加回收率为958%~1055%
8 “甲醇+水（60+40）”定容至 100mL，配制成 50μg/mL 的染料木素和 32μg/mL 的大豆苷元标准溶液。 4. 测定步骤 （1）样品处理： a. 固体样品：准确称取一定量固体粉末样品于100mL容量瓶中，定量加入80%乙醇，经超声振荡5min， 加水补足至刻度，待提取液略澄清后经离心分离（3000r/min，5min），取上清液经 0.45μm 滤膜过滤后待 进样。 b. 液体样品：准确吸取 2.0mL 液体样品，加入 80%乙醇摇匀并定容 100mL，澄清后同上述步骤。 （2）色谱分离条件： 色 谱 柱：Shim—Pack CLC—ODS，6mm×l50mm，5μm。 流 动 相：甲醇+水（60+40），临用前用超声波除气。 流 速：0～5min，为 1.0mL/min；5～10min 为 1.6mL/min。 柱 温：40℃。 检测波长：UV260nm。 灵 敏 度：0.016AUFS。 进 样 量：l0μL。 （3）样品测定：准确称取样品处理液和标准液各 l0μL（或相同体积）注入高效液相色谱仪进行分 离，以其标准溶液峰的保留时间进行定性，利用峰面积求出样液中待测物质的含量。 5. 结果计算 S m S c V X = 2 1 式中 X——样品中染料木素/大豆苷元的含量（μg/g）； S1——样品峰面积； c ——标准溶液浓度（μg/mL）； S2——标准溶液峰面积； V——样品定容体积（mL）； m——试样质量（g）。 样品中大豆异黄酮含量 X（μg/g）=Xg+Xd(Xg、Xd 分别为样品中染料木素及大豆苷元的含量) 6. 注释 （1）本法染料木素浓度在 0.01～0.1mg/mL 范围内呈直线关系，相关系数为 0.9996；大豆苷元浓度在 0.003～0.03mg/mL 范围内呈直线关系，相关系数 0.9945。 （2）精密度：同一样品依本法重复 6 次，染料木素、大豆苷元的相对标准差（RSD）分别为 3.1%及 1.2%。 （3）回收率：依本法各取试样 9 份，每 3 份为一组，分别加入不同量标准品进行试样处理，染料木 素添加回收率为 95.0%～103.7%、大豆苷元添加回收率为 95.8%～105.5%
第三节总皂苷的测定方法(分光光度法) 本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定。 本方法人参皂苷Re的最低检出量为2pgmL 方法提要 样品中总皂苷经提取、PT一大孔吸附树脂柱预分离后,在酸性条件下,香草醛与人参皂苷生成有色 化合物,以人参皂苷Re为对照品,于560nm处比色测定 二、仪器 1.722分光光度计 2PT一大孔吸附树脂柱(河北省津杨滤材厂) 3.超声波振荡器。 试剂 1.甲醇(分析纯) 2.乙醇(分析纯) 3.人参皂苷Re标准品(中国药品生物制品检定所)。 4-5%香草醛溶液:称取5g香草醛,加冰乙酸溶解并定容至0omL 5高氯酸(分析纯) 6冰乙酸(分析纯)。 7.人参皂苷Re标准溶液:精确称取人参皂苷Re标准品20.0mg,用甲醇溶解并定容至10mL,即每lmL 含人参皂苷Re20mg 8重蒸水 四、测定步骤 1样品处理 (1)固体样品 称取10g左右样品于100mL烧杯中,加入20~4mL85%乙醇,超声波振荡30min,再定容至s0mL, 摇匀,放置,吸取上清液l.0mL挥干后以水溶解残渣,进行柱分离 (2)液体样品 含乙醇的酒类样品:准确吸取1.mL样品放于蒸发皿中,蒸干,用水溶解残渣,用此液进行柱层析 非乙醇类液体样品:准确吸取l.σmL样品(如浓度高或颜色深,需稀释一定体积后再取l.OmL)直接进行 柱分离。 2.柱层析 以PI一大孔吸附树脂柱进行层析分离,准确吸取上述已处理好的样品溶液10mL上柱,用15mL水 洗柱,以洗去糖分等水溶性杂质,弃去洗脱液,再用20mL85%乙醇洗脱总皂苷,收集洗脱液于蒸发皿中, 于水浴上蒸干,以此作显色用 3显色
9 第三节 总皂苷的测定方法（分光光度法） 本方法适用于功能性食品中总皂苷的测定。 本方法人参皂苷 Re 的最低检出量为 2μg/mL。 一、方法提要 样品中总皂苷经提取、PT—大孔吸附树脂柱预分离后，在酸性条件下，香草醛与人参皂苷生成有色 化合物，以人参皂苷 Re 为对照品，于 560nm 处比色测定。 二、仪器 1.722 分光光度计。 2.PT—大孔吸附树脂柱（河北省津杨滤材厂）。 3.超声波振荡器。 三、试剂 1.甲醇（分析纯）。 2.乙醇（分析纯）。 3.人参皂苷 Re 标准品（中国药品生物制品检定所）。 4.5％香草醛溶液：称取 5g 香草醛，加冰乙酸溶解并定容至 l00mL。 5.高氯酸（分析纯）。 6.冰乙酸（分析纯）。 7.人参皂苷 Re 标准溶液：精确称取人参皂苷 Re 标准品 20.0mg，用甲醇溶解并定容至 10mL，即每 1mL 含人参皂苷 Re2.0mg。 8.重蒸水。 四、测定步骤 1.样品处理： （1）固体样品 称取 1.0g 左右样品于 100mL 烧杯中，加入 20～40mL 85%乙醇，超声波振荡 30min，再定容至 50mL， 摇匀，放置，吸取上清液 1.0mL 挥干后以水溶解残渣，进行柱分离。 （2）液体样品 含乙醇的酒类样品：准确吸取 1.0mL 样品放于蒸发皿中，蒸干，用水溶解残渣，用此液进行柱层析； 非乙醇类液体样品：准确吸取 1.0mL 样品（如浓度高或颜色深，需稀释一定体积后再取 1.0mL）直接进行 柱分离。 2.柱层析 以 PT—大孔吸附树脂柱进行层析分离，准确吸取上述已处理好的样品溶液 1.0mL 上柱，用 15mL 水 洗柱，以洗去糖分等水溶性杂质，弃去洗脱液，再用 20mL85%乙醇洗脱总皂苷，收集洗脱液于蒸发皿中， 于水浴上蒸干，以此作显色用。 3 显色
在上述已挥干的蒸发皿中准确加入02mL5%香草醛冰乙酸溶液,转动蒸发皿,使残渣溶解,再加O.8mL 高氯酸,混匀后移入0mL比色管中,塞紧盖子于60℃以下水浴上加温15mn取出,冷却后准确加入冰乙 酸50mL,摇匀后以1.0cm比色皿、于560nm处与人参皂苷Re标准管同时比色 4标准曲线的绘制 吸取人参皂苷Re标准溶液(2.0mg/mL)0、20、40、60、80、1004L(相当于人参皂苷Re0、40、80 120、160、200μg),于10mL比色管中,用氮气吹干,同4.(3)显色步骤测定吸光度。并绘制标准曲线 人参总皂苷浓度为20~200g/mL之间与吸光度值呈线性关系,相关系数(r)0.999 五、结果计算 X= x V1×1000 mxl×1000×1000 式中X一样品中总皂苷(以人参皂苷Re计)(gkg或g/L); m一试样质量或试液体积(g或mL) V1-一样品提取液总体积(mL) 2一样品提取液测定用体积(mL) m——从标准曲线查得待测液中人参皂苷Re量(pg) 六、注释 1.人参系五加科植物是人参 Panax ginseng C A Meyer的根,含有多种人参皂苷( ginsenoside),多数为达 玛烷型皂苷,如人参皂苷Ra、Ra、Rb、Rb2、Rb3、Re、Rd等:;少数为齐墩果酸型(C型)皂苷,如人 参皂苷Re。由于苷元不同,达玛烷型皂苷又分为:20S一原人参二醇类皂苷(A型)和20S—原人参三醇 类皂苷(B型)。其中,A型和B型皂苷酸水解后,分别得到人参二醇( Panaxadiol)和人参三醇( panaxatriol) 除人参外,五加科的西洋参、三七、刺人参、刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物。 当保健食品原料配方中含有上述多种原料时,即以本法“总皂苷(以人参皂苷Re计)”报告检测结果。 2.对于人参、西洋参、绞股蓝纯品或以其为主要原料加工的保健食品,按《中华人民共和国药典》2000 年版一部第99页,以薄层色谱法进行鉴定试验,将受试品色谱与对照药材色谱及对照品色谱进行比较确 定其主要原料后,人参、西洋参制品仍以人参皂苷Re为对照品进行检测,而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷 (中国药品生物制品检定所)为对照品进行检测,分别以“人参总皂苷”、“西洋参总皂苷”、“绞股蓝总皂 苷”报告检测结果 3回收率:90%~105% 第四节褪黑素的测定方法(高效液相色谱法 本方法适用于功能性食品中褪黑素片剂的测定,非添加褪黑素的天然食品可参照此法。 本方法褪黑素的最低检出量为25ng。 、方法提要 样品中的褪黑素用甲醇提取后,经高效液相色谱分离,在紫外检测器上检测,波长260mm,用外标 法定量,根据峰面积值计算样品中褪黑素的含量
10 在上述已挥干的蒸发皿中准确加入0.2mL 5％香草醛冰乙酸溶液，转动蒸发皿，使残渣溶解，再加0.8mL 高氯酸，混匀后移入 l0mL 比色管中，塞紧盖子于 60℃以下水浴上加温 15min 取出，冷却后准确加入冰乙 酸 5.0mL，摇匀后以 1.0cm 比色皿、于 560nm 处与人参皂苷 Re 标准管同时比色。 4 标准曲线的绘制： 吸取人参皂苷 Re 标准溶液（2.0mg/mL）0、20、40、60、80、100μL（相当于人参皂苷 Re0、40、80、 120、160、200μg），于 10mL 比色管中，用氮气吹干，同 4.（3）显色步骤测定吸光度。并绘制标准曲线。 人参总皂苷浓度为 20～200μg/mL 之间与吸光度值呈线性关系，相关系数（r）0.999。 五、结果计算 1000 1000 1000 2 1 1 = m V m V X 式中 X——样品中总皂苷（以人参皂苷 Re 计）（g/kg 或 g/L）； m——试样质量或试液体积（g 或 mL）； V1——样品提取液总体积（mL）； V2——样品提取液测定用体积（mL）； m1——从标准曲线查得待测液中人参皂苷 Re 量（μg）。 六、注释 1.人参系五加科植物是人参 Panax ginseng C A Meyer 的根，含有多种人参皂苷(ginsenoside)，多数为达 玛烷型皂苷，如人参皂苷 Ral、Ra2、Rbl、Rb2、Rb3、Re、Rd 等；少数为齐墩果酸型（C 型）皂苷，如人 参皂苷 Re。由于苷元不同，达玛烷型皂苷又分为：20S—原人参二醇类皂苷（A 型）和 20S—原人参三醇 类皂苷（B 型）。其中，A 型和 B 型皂苷酸水解后，分别得到人参二醇（Panaxadial）和人参三醇（panaxatriol）。 除人参外，五加科的西洋参、三七、刺人参、刺五加和葫芦科的绞股蓝中亦含有与人参皂苷类似的化合物。 当保健食品原料配方中含有上述多种原料时，即以本法“总皂苷（以人参皂苷 Re 计）”报告检测结果。 2.对于人参、西洋参、绞股蓝纯品或以其为主要原料加工的保健食品，按《中华人民共和国药典》2000 年版一部第 99 页，以薄层色谱法进行鉴定试验，将受试品色谱与对照药材色谱及对照品色谱进行比较确 定其主要原料后，人参、西洋参制品仍以人参皂苷 Re 为对照品进行检测，而绞股蓝制品以绞股蓝总皂苷 （中国药品生物制品检定所）为对照品进行检测，分别以“人参总皂苷”、“西洋参总皂苷”、“绞股蓝总皂 苷”报告检测结果。 3.回收率：90%～105%。 第四节 褪黑素的测定方法（高效液相色谱法） 本方法适用于功能性食品中褪黑素片剂的测定，非添加褪黑素的天然食品可参照此法。 本方法褪黑素的最低检出量为 25ng。 一、方法提要 样品中的褪黑素用甲醇提取后，经高效液相色谱分离，在紫外检测器上检测，波长 260mm，用外标 法定量，根据峰面积值计算样品中褪黑素的含量