GB4789.4-2010 无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36C±！℃培养8h~ 18h。 如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min,或2℃一5℃不超过18h解冻。 5.2增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL,转种于10 mLTTB内，于42℃±1℃培养18h一24 h。同时，另取1mL,转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h~24h. 5.3分离 分别用接种环取增南液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板)。于36℃±1℃分别培养18h~24h(X1D琼 、HE琼脂 平板、沙门氏茵属显色培养基平板)或40h~48h(BS琼脂平板)，观察各个平板上生长的菌落。 各个平板上的菌落特征见表1。 表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 少门氏菌 BS琼脂 南落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色：有些 菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE琼脂 蓝绿色或蓝色，多数南落中心黑色或几乎全黑色：有些黄株为黄色，中心黑色或 机平全里佰 XLD琼脂 菌落星粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可孕现大的带光泽的黑色中心，或 呈现全部黑色的菌落：有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心， 沙门氏菌属显色培养基按照显色培养基的说明进行判定。 5.4生化试验 5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线 再于底层穿刺：接种针不要灭菌，直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃ 培养18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁球脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属 的反应结果见表2 表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 赖氨酸脱羧南试验培养基 初步判断 斜面底层 产气 硫化氢 可疑沙门氏菌属 A 十（一 +(一 可疑沙门氏南屈 A A +(一) +(一) + 可疑沙门氏南属 +/- 非沙门氏 +1 非沙门氏菌 注：K:产碱，A:产酸：十：阳性，一：阴性：十（一）：多数阳性，少数阴性：十/一：阳性或阴性。 5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时，可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试 验)、尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌 落的平板储存于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查
GB 4789.4—2010 4 无菌操作将样品转至 500 mL 锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于 36 ℃±1 ℃培养 8 h～ 18h。 如为冷冻产品,应在 45 ℃以下不超过 15 min,或 2 ℃～5 ℃不超过 18 h 解冻。 5.2 增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取 1 mL，转种于 10 mL TTB 内，于 42 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。同时，另取 1 mL，转种于 10 mL SC 内，于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 5.3 分离 分别用接种环取增菌液 1 环，划线接种于一个 BS 琼脂平板和一个 XLD 琼脂平板（或 HE 琼脂 平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于 36 ℃±1 ℃分别培养 18 h～24 h （XLD 琼脂平板、HE 琼脂 平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或 40 h～48 h （BS 琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落, 各个平板上的菌落特征见表 1。 表 1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征 选择性琼脂平板 沙门氏菌 BS 琼脂 菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色，菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些 菌株形成灰绿色的菌落，周围培养基不变。 HE 琼脂 蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全黑色；有些菌株为黄色，中心黑色或 几乎全黑色。 XLD 琼脂 菌落呈粉红色，带或不带黑色中心，有些菌株可呈现大的带光泽的黑色中心，或 呈现全部黑色的菌落；有些菌株为黄色菌落，带或不带黑色中心。 沙门氏菌属显色培养基 按照显色培养基的说明进行判定。 5.4 生化试验 5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取 2 个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线， 再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于 36 ℃±1 ℃ 培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属 的反应结果见表 2。 表 2 沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果 三糖铁琼脂 初步判断 斜面 底层 产气 硫化氢 赖氨酸脱羧酶试验培养基 K A ＋（－） ＋（－） ＋ 可疑沙门氏菌属 K A ＋（－） ＋（－） － 可疑沙门氏菌属 A A ＋（－） ＋（－） ＋ 可疑沙门氏菌属 A A ＋/－ ＋/－ － 非沙门氏菌 K K ＋/－ ＋/－ ＋/－ 非沙门氏菌 注：K：产碱，A：产酸；＋：阳性，－：阴性；＋（－）：多数阳性，少数阴性；＋/－：阳性或阴性。 5.4.2 接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试 验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑 取可疑菌落接种。于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h，必要时可延长至 48 h，按表 3 判定结果。将已挑菌 落的平板储存于 2 ℃～5 ℃或室温至少保留 24 h，以备必要时复查
GB4789.4-2010 表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号硫化氢靛基质H72尿素氧化钾 款氨酸脱羧酸 (HS) (KCN) A2 十 A3 +/ 注：+阳性：一阴性：+/一闲性或阴性。 5.4.2.1反应序号A1:典型反应判定为沙门氏茵属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1 项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。 表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 H72尿素化钾(KCN) 判定结果 脱 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果》 + 沙门氏菌V或V(要求符合本群生化特性) 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：十表示阳性：+表示阴性。 5.4.2.2反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏茵靛基质阳性变体两项试验结果均为阳 性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定， 5.4.2.3反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性，甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 5.4.2.4必要时按表5进行沙门氏南生化群的鉴别。 表5沙门氏菌属各生化群的鉴别 项目 卫矛醇 型醇 水杨苷 ONPG 丙二酸盐 KCN 注：十表示阳性：一表示性。 5.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营 养琼脂平板上挑取可疑茵落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定 5.5血清学鉴定 5.5.1抗原的准备 一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 0血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2%一3%） 培养基上再检查：如果是由于 抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰
GB 4789.4—2010 5 表 3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 反应序号 硫化氢 （H2S） 靛基质 pH 7.2 尿素 氰化钾 （KCN） 赖氨酸脱羧酶 A1 ＋ － － － ＋ A2 ＋ ＋ － － ＋ A3 － － － － ＋/－ 注：＋阳性；－阴性；＋/－阳性或阴性。 5.4.2.1 反应序号 A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN 和赖氨酸脱羧酶 3 项中有 1 项异常，按表 4 可判定为沙门氏菌。 如有 2 项异常为非沙门氏菌。 表 4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表 pH 7.2 尿素 氰化钾（KCN） 赖氨酸 脱羧酶 判 定 结 果 － － － 甲型副伤寒沙门氏菌（要求血清学鉴定结果） － ＋ ＋ 沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性） ＋ － ＋ 沙门氏菌个别变体（要求血清学鉴定结果） 注：＋表示阳性；＋表示阴性。 5.4.2.2 反应序号 A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳 性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 5.4.2.3 反应序号 A3：补做 ONPG。ONPG 阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒 沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。 5.4.2.4 必要时按表 5 进行沙门氏菌生化群的鉴别。 表 5 沙门氏菌属各生化群的鉴别 项 目 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ 卫矛醇 ＋ ＋ － － ＋ － 山梨醇 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － 水杨苷 － － － ＋ － － ONPG － － ＋ － ＋ － 丙二酸盐 － ＋ ＋ － － － KCN － － － ＋ ＋ － 注：＋表示阳性; －表示阴性。 5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据 5.4.1 的初步判断结果，从营 养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动 微生物生化鉴定系统进行鉴定。 5.5 血清学鉴定 5.5.1 抗原的准备 一般采用 1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。 O 血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如 2％～3％） 培养基上再检查；如果是由于 Vi 抗原的存在而阻止了 O 凝集反应时，可挑取菌苔于 1 mL 生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰
GB4789.4-2010 上煮沸后再检查。H抗原发有不良时，将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央，俟菌落 蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查：或将菌株通过装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次一2 次，自远端取茵培养后再拾查 5.5.2多价菌体抗原(0)鉴定 在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放12环于玻片上的每一区域上 部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的茵落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1mi,并对 者黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3多价鞭毛抗原(H)鉴定 同5.52。 5.5.4血洁学分型（选做项目】 5.5.4.10抗原的鉴定 用A~F多价0血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形 菌株，不能分型。 被AP多价0血清凝集者，依次用O4:O3、010：07:O8:O9:O2和O11因子血清做凝里 试验。根据试验结果，判定0群。被O3、010血清凝集的菌株，再用010、O15、034、O19单因 子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每 一个0抗原成分的最后确定均应根据0单因 子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。 不被A一F多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，测用这种 血清所包括的0群血清逐一检查，以确定0群。每种多价0血清所包括的0因子如下： 0老份 A,B,C,D,E,E,群 （并包括6,14群 0多价213,16,17,18,21群 0多价328,30,35,38,39群 0多价440,41,42,43群 0多价5 44,45,47,48看 0多价650,51,52,53群 0多价755,56,57,58群 0多价859,60.61,62群 0多价9 63,65,66,67群 5.5.4.2H抗原的鉴定 属于A~F各0群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。 表6A一F群常见菌型H抗原表 0群 第1相 第2相 B gfs B ibd CI k.vrc 5z15 2 D(不产气的 D(产气的》 8.m.p.q 无无 h.v 6.x E4 g.st 无 E4
GB 4789.4—2010 6 上煮沸后再检查。H 抗原发育不良时，将菌株接种在 0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落 蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有 0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管 1 次～2 次，自远端取菌培养后再检查。 5.5.2 多价菌体抗原（O）鉴定 在玻片上划出 2 个约 1 cm×2 cm 的区域，挑取 1 环待测菌，各放 1/2 环于玻片上的每一区域上 部，在其中一个区域下部加 1 滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入 1 滴生理盐水，作为对 照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合 1 min，并对 着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。 5.5.3 多价鞭毛抗原（H）鉴定 同 5.5.2。 5.5.4 血清学分型（选做项目） 5.5.4.1 O 抗原的鉴定 用 A～F 多价 O 血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形 菌株，不能分型。 被 A～F 多价 O 血清凝集者，依次用 O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2 和 O11 因子血清做凝集 试验。根据试验结果，判定 O 群。被 O3、O10 血清凝集的菌株，再用 O10、O15、O34、O19 单因 子血清做凝集试验，判定 E1、E2、E3、E4 各亚群，每一个 O 抗原成分的最后确定均应根据 O 单因 子血清的检查结果，没有 O 单因子血清的要用两个 O 复合因子血清进行核对。 不被 A～F 多价 O 血清凝集者，先用 9 种多价 O 血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种 血清所包括的 O 群血清逐一检查，以确定 O 群。每种多价 O 血清所包括的 O 因子如下： O 多价 1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括 6,14 群） O 多价 2 13，16，17，18，21 群 O 多价 3 28，30，35，38，39 群 O 多价 4 40，41，42，43 群 O 多价 5 44，45，47，48 群 O 多价 6 50，51，52，53 群 O 多价 7 55，56，57，58 群 O 多价 8 59，60，61，62 群 O 多价 9 63，65，66，67 群 5.5.4.2 H 抗原的鉴定 属于 A～F 各 O 群的常见菌型，依次用表 6 所述 H 因子血清检查第 1 相和第 2 相的 H 抗原。 表 6 A～F 群常见菌型 H 抗原表 O 群 第 1 相 第 2 相 A B B C1 C2 D（ 不产气的） D（产气的） E1 E4 E4 a g,f,s i,b,d k,v,r,c b,d,r d g,m,p,q h,v g,s,t i 无 无 2 5,z15 2,5 无 无 6,w,x 无