EDTA也能提高酶的通透量,而尿素有相反的作用 通过控制影响蛋白质超滤特性的因素,可使纯化倍数得到明显的提高,如经超滤可使大肠杆 菌青霉素酶的纯度提高7倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质,如从酶液中去掉乙醇或 脱盐,这种过程称为析滤。 334酶的进一步纯化 3.34l吸附层析 羟基磷灰石( hydroxyapatite,HA)是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂,它是一种白色颗 粒,分子式为Ca(PO4)6(OH2,它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完 全清楚,一般认为HA的结晶表面外露的Ca和PO43参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋 白质与HA上的Ca2+位点结合,高浓度的NaCl、KCl或CaCl2的存在既不影响两者的结合,也不 影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用pH约68的低浓度磷酸缓冲液(20~120 mmol/L)。 碱性蛋白质是结合在HA的PO43基团上,NaCl、KCl或CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。 一般可用这些盐或浓度为120~230mmo/L的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓 度很高的CaCl也洗不下来。总之,不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸 缓冲液条件下上样,然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱,从而使各种蛋白质 分离。HA柱的再生方法是:500mmo仉L磷酸钾缓冲液→100 mmol/L磷酸钾缓冲液→水→起始缓 冲液平衡(起始缓冲液为5、10或20 mmol/L磷酸钾缓冲液)。 3342离子交换层析 离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类,阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换 基团,常见的阳离子交换基团有-SOH、-COOH、CH2COOH(CM)等;阴离子交换剂的衬质 上带有阴离子交换基团,常见的阴离子交换基团有NH3C、二乙基胺乙基(DEAE)等。蛋白 质分子上具有各种阴阳离子基团,在一定的pH和离子强度下,这些基团可与离子交换剂上的相 应基团进行离子交换,使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变pH和(或)离子 强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下,不同的蛋白质分子所带的 净电荷和电荷密度不同,分子大小也不同,它们与离子交换剂的结合力不同,结合力较弱的先洗 脱下来,结合力较强的后洗脱下来,从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗 脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的pH,也可改变洗脱液的离子强度,或者二者同时改变
6 EDTA 也能提高酶的通透量，而尿素有相反的作用。 通过控制影响蛋白质超滤特性的因素，可使纯化倍数得到明显的提高，如经超滤可使大肠杆 菌青霉素酶的纯度提高 7 倍。超滤也可用于快速除去大量的低分子溶质，如从酶液中去掉乙醇或 脱盐，这种过程称为析滤。 3.3.4 酶的进一步纯化 3.3.4.1 吸附层析 羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是最常用于蛋白质分离的一种吸附剂，它是一种白色颗 粒，分子式为 Ca10(PO4)6(OH)2，它非特异性地吸附蛋白质。羟基磷灰石分离大分子的机理还不完 全清楚，一般认为 HA 的结晶表面外露的 Ca 2+和 PO4 3－参与大分子的分级分离。酸性和中性的蛋 白质与 HA 上的 Ca 2+位点结合，高浓度的 NaCl、KCl 或 CaCl2的存在既不影响两者的结合，也不 影响洗脱。酸性和中性蛋白质的洗脱一般是用 pH 约 6.8 的低浓度磷酸缓冲液（20～120mmol/L）。 碱性蛋白质是结合在 HA 的 PO4 3－基团上，NaCl、KCl 或 CaCl2的存在会强烈影响吸附和洗脱。 一般可用这些盐或浓度为 120～230mmol/L 的磷酸缓冲液进行洗脱。但也有一些碱性蛋白质用浓 度很高的 CaCl2也洗不下来。总之，不同的蛋白质洗脱所需的条件不同。一般将酶在低浓度磷酸 缓冲液条件下上样，然后用逐渐增加磷酸盐浓度的阶段洗脱或浓度梯度洗脱，从而使各种蛋白质 分离。HA 柱的再生方法是：500mmol/L 磷酸钾缓冲液→100 mmol/L 磷酸钾缓冲液→水→起始缓 冲液平衡（起始缓冲液为 5、10 或 20 mmol/L 磷酸钾缓冲液）。 3.3.4.2 离子交换层析 离子交换剂分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两类，阳离子交换剂的衬质上带有阳离子交换 基团，常见的阳离子交换基团有-SO3H、-COOH、-CH2COOH（CM）等；阴离子交换剂的衬质 上带有阴离子交换基团，常见的阴离子交换基团有-NH3＋Cl－、二乙基胺乙基（DEAE）等。蛋白 质分子上具有各种阴阳离子基团，在一定的 pH 和离子强度下，这些基团可与离子交换剂上的相 应基团进行离子交换，使蛋白质分子通过静电引力吸附到离子交换剂上。改变 pH 和（或）离子 强度又可将这些吸附的蛋白质洗脱下来。在一定的上样和洗脱条件下，不同的蛋白质分子所带的 净电荷和电荷密度不同，分子大小也不同，它们与离子交换剂的结合力不同，结合力较弱的先洗 脱下来，结合力较强的后洗脱下来，从而达到分离的目的。洗脱的方式有单一溶液洗脱、阶段洗 脱和浓度梯度洗脱等。可改变洗脱液的 pH，也可改变洗脱液的离子强度，或者二者同时改变
在一般情况下,碱性蛋白质(等电点大于plH70)在pH小于等电点时带正电荷,被阳离子交换 剂吸附;酸性蛋白质(等电点小于pH70)在pH大于等电点时带负电荷,被阴离子交换剂吸附 离子交换剂的衬质(也称载体)常见的有树脂( resin)、纤维素( cellulose)、葡聚糖凝胶 ( Sephadex)、琼脂糖凝胶( Sepharose)、丙烯酸共聚物( Trisacryl)等。其中离子交换树脂物理 性能稳定,蛋白质吸附容量高,装柱时沉降迅速,洗脱时允许高流速,但它的高吸附力用于蛋白 质纯化时却往往是缺点,因为蛋白质可能经受不住从树脂上洗脱下来所必需的激烈条件,所以不 常用于蛋白质的纯化。离子交换纤维素价格低廉,交换容量较低,一般为离子交换树脂交换容量 的,,洗脱条件温和,是常用的离子交换剂。离子交换 Sephadex凝胶是在 Sephadex G-25或 Sephadex G-50上引入DEAE或CM基团制备成的。以 Sephadex G-50为衬质的离子交换凝胶具 有高蛋白容量,但它们较软,而且在缓冲液pH或离子强度改变时会收缩或膨胀,不宜用于柱层 析。把DEAE或CM基团引入交联琼脂糖或丙烯酸共聚物可得到离子交换 Sepharose和 Trisacryl 这两种类型的离子交换剂是由小而均匀的、能确保高流速的珠形颗粒组成,具有高蛋白容量。它 们在一般层析压力下不变形,更重要的是它们在离子强度改变时及极端pH下都不会收缩或膨胀 因此可在柱中再生。再生的方法是 阳离子交换剂0.5NHCl→05 NAoH→0.5NHCl→水→平衡 阴离子交换剂0.5 N NaOH→0.5NHCl→0.5 N NaOH→水→平衡 3.43凝胶过滤层析 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析。凝胶层析的原理可以用3-氯-1,2-环氧丙烷 交联的 Sephadex凝胶来说明。所用的葡聚糖是由肠膜明串珠菌产生的产物,葡萄糖残基主要以 α-1,6-糖苷键联结。交联程度受所用的3-氯-1,2-环氧丙烷含量控制,从而决定了凝胶基质的水合 (复得水)程度及凝胶的孔隙度。每单位干重凝胶复得的水越多,其孔隙度也越大,它所能分级 分离的分子也越大。葡聚糖/交联剂之比越大,孔隙度也越大,反之孔隙度小。若将一混合物上 样到柱的上端,洗脱时,大分子量的分子因不能进入凝胶颗粒内部的孔隙而最先流出,而小分子 量的分子因能进入凝胶颗粒内部,延长了行进的路线而后流出。不能进入凝胶颗粒内部的最小分 子的分子量称为该凝胶的排阻限度。在能进入凝胶颗粒内部的分子当中,分子量较大的先流出, 分子量较小的后流出,这样就能将不同分子量大小的物质分开。将洗脱液分部收集,找出酶活性
7 在一般情况下，碱性蛋白质（等电点大于 pH7.0）在 pH 小于等电点时带正电荷，被阳离子交换 剂吸附；酸性蛋白质（等电点小于 pH7.0）在 pH 大于等电点时带负电荷，被阴离子交换剂吸附。 离子交换剂的衬质（也称载体）常见的有树脂（resin）、纤维素（cellulose）、葡聚糖凝胶 （Sephadex）、琼脂糖凝胶（Sepharose）、丙烯酸共聚物（Trisacryl）等。其中离子交换树脂物理 性能稳定，蛋白质吸附容量高，装柱时沉降迅速，洗脱时允许高流速，但它的高吸附力用于蛋白 质纯化时却往往是缺点，因为蛋白质可能经受不住从树脂上洗脱下来所必需的激烈条件，所以不 常用于蛋白质的纯化。离子交换纤维素价格低廉，交换容量较低，一般为离子交换树脂交换容量 的 10 1 ，洗脱条件温和，是常用的离子交换剂。离子交换 Sephadex 凝胶是在 Sephadex G-25 或 Sephadex G-50 上引入 DEAE 或 CM 基团制备成的。以 Sephadex G-50 为衬质的离子交换凝胶具 有高蛋白容量，但它们较软，而且在缓冲液 pH 或离子强度改变时会收缩或膨胀，不宜用于柱层 析。把 DEAE 或 CM 基团引入交联琼脂糖或丙烯酸共聚物可得到离子交换 Sepharose 和 Trisacryl。 这两种类型的离子交换剂是由小而均匀的、能确保高流速的珠形颗粒组成，具有高蛋白容量。它 们在一般层析压力下不变形，更重要的是它们在离子强度改变时及极端 pH 下都不会收缩或膨胀， 因此可在柱中再生。再生的方法是： 阳离子交换剂 0.5N HCl→0.5N NaOH→0.5N HCl→水→平衡 阴离子交换剂 0.5N NaOH→0.5N HCl→0.5N NaOH→水→平衡 3.3.4.3 凝胶过滤层析 凝胶层析也称凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析。凝胶层析的原理可以用 3-氯-1,2-环氧丙烷 交联的 Sephadex 凝胶来说明。所用的葡聚糖是由肠膜明串珠菌产生的产物，葡萄糖残基主要以 α-1,6-糖苷键联结。交联程度受所用的 3-氯-1,2-环氧丙烷含量控制，从而决定了凝胶基质的水合 （复得水）程度及凝胶的孔隙度。每单位干重凝胶复得的水越多，其孔隙度也越大，它所能分级 分离的分子也越大。葡聚糖／交联剂之比越大，孔隙度也越大，反之孔隙度小。若将一混合物上 样到柱的上端，洗脱时，大分子量的分子因不能进入凝胶颗粒内部的孔隙而最先流出，而小分子 量的分子因能进入凝胶颗粒内部，延长了行进的路线而后流出。不能进入凝胶颗粒内部的最小分 子的分子量称为该凝胶的排阻限度。在能进入凝胶颗粒内部的分子当中，分子量较大的先流出， 分子量较小的后流出，这样就能将不同分子量大小的物质分开。将洗脱液分部收集，找出酶活性