《生物技术制药》实验指导实验五：DNA的回收与连接【实验目的】外源DNA1.掌握DNA逆2.学会DNAEECoRmEoH【实验原理】将载体pUC118kb BamHI+EcoRI片段1:hgas用T4DNA连接酶连转化大肠杆菌T4-ligase
《生物技术制药》实验指导 18 实验五 DNA 的回收与连接 【实验目的】 1．掌握 DNA 连接的的方式和影响连接反应的因素。 2．学会 DNA 回收和连接技术。 【实验原理】 将载体 pUC118 用 BamHI + EcoRI 酶切，与目的基因 1.0kb BamHI + EcoRI 片段 用 T4DNA 连接酶连接起来。 T4-ligase
《生物技术制药》实验指导图5-1目的DNA与质粒连接示意图【实验材料和试剂】（一）实验材料1.实验二提取的质粒pUC1182.质粒pSYX1，可用BamHI+EcoRI切下1.0kb目的DNA。（二）试剂1.限制性内切酶BamHI和EcoRI2.DNA/HindIII分子量标准3.双蒸馏无菌水4.上海生工SilverBeadsDNA胶回收试剂盒5.溴酚蓝指示剂点样缓冲液6.1mg/ml溴化乙锭溶液7.电泳缓冲液（TAE）8.LB培养基9.X-gal（20mg/ml）：5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷（配制方法：用二甲基甲酰胺溶解X-gal，配制成20mg/ml的贮存液。防止光照破坏，-20℃保存）10：IPTG（20mg/ml）：异丙基硫代--D-半乳糖苷（配制方法：用蒸馏水配制成20mg/ml的贮存液，-20℃保存）（三）器材1.5mlEppendorf管、2001吸头、90mm培养血、1ml移液管、手术刀片、三角爬。19
《生物技术制药》实验指导 19 图 5-1 目的 DNA 与质粒连接示意图 【实验材料和试剂】 （一）实验材料 1．实验二提取的质粒 pUC118 2．质粒 pSYX1，可用 BamHI + EcoRI 切下 1.0kb 目的 DNA。 （二）试剂 1．限制性内切酶 BamHI 和 EcoRI 2． HindIII 分子量标准 3．双蒸馏无菌水 4．上海生工 Silver Beads DNA 胶回收试剂盒 5．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 6．1mg/ml 溴化乙锭溶液 7．电泳缓冲液（TAE） 8．LB 培养基 9．X-gal（20mg/ml）：5-溴-4-氯-3-吲哚- -D-半乳糖苷 （配制方法：用二甲基甲酰胺溶解 X-gal，配制成 20mg/ml 的贮存液。防止光照 破坏，-20℃保存） 10．IPTG（20mg/ml）：异丙基硫代- -D-半乳糖苷 （配制方法：用蒸馏水配制成 20mg/ml 的贮存液，-20℃保存） （三）器材 1.5ml Eppendorf 管、200 l 吸头、90mm 培养皿、1ml 移液管、手术刀片、三角爬
《生物技术制药》实验指导（四）仪器微量移液器、离心机、恒温水浴锅、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪【实验步骤】（一）载体的线性化和制备目的基因片段1.取一个灭菌的Eppendorf管，依此加入下列试剂：11 1双蒸馏无菌水10x缓冲液2151质粒pUC118BamHI11EcoRI1 1总体积2012.取一个灭菌的Eppendorf管，依此加入下列试剂：双蒸馏无菌水11 110x缓冲液2 151pSYX1BamHI11EcoRI11201总体积3.用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。4.置37℃水浴60~120分钟。5.加入51溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果，鉴定酶切效果。6.用干净的手术刀从琼脂糖凝胶中分别割下含有3.2kbDNA条带（pUC118）20
《生物技术制药》实验指导 20 （四）仪器 微量移液器、离心机、恒温水浴锅、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪。 【实验步骤】 （一）载体的线性化和制备目的基因片段 1. 取一个灭菌的 Eppendorf 管，依此加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 10×缓冲液 质粒 pUC118 BamHI EcoRI 总体积 2. 取一个灭菌的 Eppendorf 管，依此加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 10×缓冲液 BamHI Eco 总体积 3．用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。 4. 置 37℃水浴 60～120 分钟。 5. 加入 溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果， 鉴定酶切效果。 6．用干净的手术刀从琼脂糖凝胶中分别割下含有 3.2 kb DNA 条带（pUC118）
《生物技术制药》实验指导和1.0kbDNA条带（目的DNA）的琼脂块，各自放入灭菌的Eppendorf管中7按每100mg琼脂糖凝胶中加入4001SolubizationSolution和101SilverBeads（使用前充分混匀），50~60℃水浴中10分钟，使胶彻底融化，溶胶过程每两分钟混匀一次。8.10,000r/min高速离心1分钟，小心吸掉上清。9.用5001WashSolution将SilverBeads悬浮起来，10,000r/min高速离心1分钟。10小心吸掉上清，用5001WashSolution将SilverBeads悬浮起来，10,000r/min高速离心1分钟。11.小心吸掉上清，Eppendorf管倒置，室温干燥10分钟，不要使Beads完全干燥。12.用201ElutionBuffer或水（pH>7.0）将SilverBeads悬浮起来，室温或37℃放置5~10分钟。中途混匀若干次。13.10,000r/min高速离心1分钟，小心将洗脱液移到灭菌的Eppendorf管中，注意不要吸取Beads。14，10,000r/min高速离心1分钟，除去洗脱被中可能存在的微量的Beads。（二）连接反应1.取一个灭菌的Eppendorf管，依此加入下列试剂：81双蒸馏无菌水2110×连接酶缓冲液31pUC118/BamHI6 1目的DNA21
《生物技术制药》实验指导 21 和 1.0kb DNA 条带（目的 DNA）的琼脂块，各自放入灭菌的 Eppendorf 管中。 7．按每l00mg琼脂糖凝胶中加入 和 （使用前充分混匀），50～60℃水浴中 10 分钟，使胶彻底融化，溶胶过程每两分钟混 匀一次。 8．10,000r/min 高速离心 l 分钟，小心吸掉上清。 9．用 将 Silver Beads 悬浮起来，10,000r/min 高速离心 l 分 钟。 10．小心吸掉上清，用 将 Silver Beads 悬浮起来，10,000r/min 高速离心 1 分钟。 11．小心吸掉上清，Eppendorf 管倒置，室温干燥 10 分钟，不要使 Beads 完全干 燥。 12．用 或水（pH﹥7.0）将 Silver Beads 悬浮起来，室温或 37℃放置 5～10 分钟。中途混匀若干次。 13．10,000r/min 高速离心 1 分钟，小心将洗脱液移到灭菌的 Eppendorf 管中，注 意不要吸取 Beads。 14．10,000r/min 高速离心 1 分钟，除去洗脱被中可能存在的微量的 Beads。 （二）连接反应 1．取一个灭菌的 Eppendorf 管，依此加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 10×连接酶缓冲液 pUC118/BamHI 目的 DNA
《生物技术制药》实验指导T4DNA连接酶11总体积2012.用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。3.置16℃水浴12~16小时。4.将连接反应液转化大肠杆菌DH-5感受态细胞（具体方法见实验一）。5.制备含氨苄青霉素的LB平板，于平板表面加401X-gal和401IPTG，并用无菌三角爬将试剂均匀涂布于整个平板表面。6，取2001转化的菌液涂布于平板表面，37℃倒置平板培养20~24小时。7.观察平板上长出的菌落，蓝色菌落为载体自连转化子，白色菌落为重组DNA转化子。8.挑取白色菌落于3ml液体LB培养基（含50g/ml氨苄青霉素）中，37℃摇床培养16~20小时，提取质粒，用BamHI+EcoRI酶切分析进一步鉴定。。22
《生物技术制药》实验指导 22 T4DNA 连接酶 总体积 2．用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。 3. 置 16℃水浴 12～16 小时。 4. 将连接反应液转化大肠杆菌 DH- 感受态细胞（具体方法见实验一）。 5．制备含氨苄青霉素的 LB 平板，于平板表面加 -gal 和 ，并 用无菌三角爬将试剂均匀涂布于整个平板表面。 6．取 转化的菌液涂布于平板表面， 37℃倒置平板培养 20～24 小时。 7．观察平板上长出的菌落，蓝色菌落为载体自连转化子，白色菌落为重组 DNA 转化子。 8．挑取白色菌落于 3ml 液体 LB 培养基（含 氨苄青霉素）中，37℃摇 床培养 16～20 小时，提取质粒，用 BamHI + EcoRI 酶切分析进一步鉴定