《生物技术制药》实验指导1：选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。2，选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。3.制备0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。4：用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3~5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。5，琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。6：将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。7.将151DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。8·用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。9.盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过5V/cm（100~150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。10.电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1~3小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254nm波长的透射紫外灯下观察。3
《生物技术制药》实验指导 13 1．选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极 的线路。 2．选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部 离电泳胶模底部的距离为 1.0mm。 3．制备 0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。 4．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶 板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至 60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻 倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在 3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡 可用吸管小心吸去。 5．琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置 20 分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端 的挡板，保持点样孔的完好。 6．将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝 胶表面 1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。 7．将 样品与 1/5 体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液 不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上 样和估计电泳时间和判断电泳的位置。 8．用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。 9．盖上电泳槽，开启电源开关，最高电压不超过 5V/cm（100～150V 恒压电泳）， 使 DNA 从负极向正极移动。 10．电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需 1～3 小时。电泳完毕后关闭电 源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在 254nm 波长 的透射紫外灯下观察
《生物技术制药》实验指导【提示】（一）琼脂糖凝胶电泳1.琼脂糖凝胶的性质琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液体。浇在模板上冷却至40～45℃时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。2.DNA分子的迁移率DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。（二）实验操作中注意的问题1.加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。2，溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有漠化乙锭的面朝里。3：用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰，但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。4
《生物技术制药》实验指导 14 【提示】 （一）琼脂糖凝胶电泳 1．琼脂糖凝胶的性质 琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由 D-半乳糖和 3,6-脱水-L-半乳糖的 残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至 90～100℃左右，即可形成清亮透 明的液体。浇在模板上冷却至 40～45℃时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不 含有带电荷的基团，不引起 DNA 变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好 的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差 100bp 的 DNA 片段。 2．DNA 分子的迁移率 DNA 分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于 DNA 分子大小与构 型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液 pH 值和电泳时的温度等。 （二）实验操作中注意的问题 1．加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。 2．溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时 一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里。 3．用 254nm 波长的紫外光进行观察的效果比 366nm 清晰，但产生的切口 DNA 量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩
《生物技术制药》实验指导实验四DNA的限制性内切酶酶切【实验目的】1.学会DNA限制性内切酶酶切技术。2.琼脂糖凝胶电泳法观察酶切DNA的结果。【实验原理】质粒pUC118上有限制性内切酶BamHI的识别序列GIGATCC，用BamHI酶切后形成线性质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离DNA片段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子312量的对数成反比。要准确地确定DNA片段的大小，必须用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准/是DNA/EcoRI、DNA/HindIII、DNA/EcoRI+HindIII的酶切片段。表 4-1入噬菌体DNA的酶切片段（bp）EcoRIHindlIEcoRI+HindlI21,22623,13021,2275,1487,4219,4165,8044,9736,557图41pUC118酶切电泳图5 ,6434,3614,2681.DNA/HimdI4,8782,3223,5302.提取的pUC118样品3,5302,0272,0273.pUC118/BamHI5641,9041251,5841,375947831564125【实验材料和试剂】15
《生物技术制药》实验指导 15 实验四 DNA 的限制性内切酶酶切 【实验目的】 1. 学会 DNA 限制性内切酶酶切技术。 2. 琼脂糖凝胶电泳法观察酶切 DNA 的结果。 【实验原理】 质粒 pUC118 上有限制性内切酶 BamHI 的识别序列 G↓GATCC，用 BamHI 酶切 后形成线性质粒 DNA。琼脂糖凝胶电泳可以按酶切产物分子量的大小分离 DNA 片 段，小片段比大片段迁移快，凝胶上迁移的距离与分子 量的对数成反比。要准确地确定 DNA 片段的大小，必须 用分子量标准物同时进行电泳对照。常用的分子量标准 是 DNA/EcoRI、 HindIII、 EcoRI+HindIII 的酶切片段。 表 4-1 噬菌体 DNA 的酶切片段（bp） EcoRI HindIII EcoRI+HindIII 21 ,226 7 ,421 5 ,804 5 ,643 4 ,878 3 ,530 23 ,130 9 ,416 6 ,557 4 ,361 2 ,322 2 ,027 564 125 21 ,227 5 ,148 4 ,973 4 ,268 3 ,530 2 ,027 1 ,904 1 ,584 1 ,375 947 831 564 125 【实验材料和试剂】
《生物技术制药》实验指导（一）实验材料实验二提取的质粒pUC118(二) 试剂1.限制性内切酶BamHI2.DNA/HindIII分子量标准3.双蒸馏无菌水4.溴酚蓝指示剂点样缓冲液5.1mg/ml溴化乙锭溶液6.电泳缓冲液（TAE）7.0.7%琼脂糖凝胶（用TAE电泳缓冲液配制）（三）器材1.5mlEppendorf管2001吸头（四）仪器微量移液器、离心机、恒温水浴锅、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪【实验步骤】1.取一个灭菌的Eppendorf管，依次加入下列试剂：121双蒸馏无菌水2 110xBamHI缓冲液质粒pUC11851BamHI11总体积2012.用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液。16
《生物技术制药》实验指导 16 （一）实验材料 实验二提取的质粒 （二）试剂 1．限制性内切酶 BamHI 2．DNA/HindIII 分子量标准 3．双蒸馏无菌水 4．溴酚蓝指示剂点样缓冲液 5．1mg/ml 溴化乙锭溶液 6．电泳缓冲液（TAE） 7．0.7% 琼脂糖凝胶（用 TAE 电泳缓冲液配制） （三）器材 1.5ml Eppendorf 管 吸头 （四）仪器 微量移液器、离心机、恒温水浴锅、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪 【实验步骤】 1. 取一个灭菌的 Eppendorf 管，依次加入下列试剂： 双蒸馏无菌水 10×BamHI 缓冲液 质粒 pUC118 BamHI 总体积 20 l 2. 用手指轻弹管壁，使各种试剂混匀，快速离心，以集中溶液
《生物技术制药》实验指导3.置37℃水浴60~120分钟。4.加入51溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果，鉴定酶切效果。【提示】实验操作中注意的问题1.酶切反应用的Eppendorf管和吸头，都要用新的，用双蒸馏留水洗净，灭菌。使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染2.DNA样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全部放入反应体系中。3.要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA各项试剂，最后才加酶。4，取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。5.当样品在37℃保温时，要将Eppendorf管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密使水进入管内，造成实验失败。17
《生物技术制药》实验指导 17 3. 置 37℃水浴 60～120 分钟。 4. 加入 溴酚蓝指示剂点样缓冲液，按实验三方法电泳，观察酶切反应结果， 鉴定酶切效果。 【提示】 实验操作中注意的问题 1．酶切反应用的 Eppendorf 管和吸头，都要用新的，用双蒸馏水洗净，灭菌。 使用前打开包装，用镊子夹取，不要直接用手去拿，以防手上的杂酶污染。 2．DNA 样品和限制性内切酶的用量都极少，必须严格注意吸样量的准确性及全 部放入反应体系中。 3．要注意酶切加样的次序，一般次序为双蒸馏无菌水、缓冲液、DNA 各项试剂， 最后才加酶。 4．取酶时，吸头要从酶液的表面吸取，以防止吸头沾上过多的酶液。待用的酶 要放在冰浴内，用后盖紧盖子，立即放回-20℃冰箱中，防止酶失活。 5．当样品在 37℃保温时，要将 Eppendorf 管的盖子盖紧，防止因盖子未盖严密 使水进入管内，造成实验失败