《生物技术制药》实验指导实验六基因的PCR扩增【实验目的】1.学习PCR反应的基本原理与实验技术2.了解引物设计的一般要求【实验原理】单链DNA在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用DNA聚合酶按5→3'方向复制出互补DNA。这时单链DNA称为模板DNA，寡聚核苷酸片段称为引物（Primer），合成的互补DNA称为产物DNA。双链DNA分子经高温变性后成为两条单链DNA，它们都可作为单链模板DNA，在相应的引物引导下，用DNA聚合酶复制出产物DNA。PCR反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列DNA分子两端各设计一条引物，其中在DNA5"端的引物（PI）对应于上链DNA单链的序列，3"端的引物（P2）对应于下链DNA单链的序列，PI和P2按5'-3'方向相向配置。在含有引物、DNA合成底物dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链DNA变成单链DNA模板，降低温度复性，使引物与模板DNA配对，利用DNA聚合酶便可合成产物DNA。引物和dNTPs过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这-一循环，使产物DNA重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按2"方式扩增，所以这-一反应称为聚合酶链式扩增反应。理论上如果引物及dNTP的量能够满足，则这一过程可无限重复，使模板DNA无限扩增。PCR反应使几个DNA模板分子通过数小时扩23
《生物技术制药》实验指导 23 实验六 基因的 PCR 扩增 【实验目的】 1. 学习 PCR 反应的基本原理与实验技术。 2. 了解引物设计的一般要求。 【实验原理】 单链 DNA 在互补寡聚核苷酸片段的引导下，可以利用 DNA 聚合酶按 5’→3’方 向复制出互补 DNA。这时单链 DNA 称为模板 DNA，寡聚核苷酸片段称为引物 （Primer），合成的互补 DNA 称为产物 DNA。双链 DNA 分子经高温变性后成为两条 单链 DNA，它们都可作为单链模板 DNA，在相应的引物引导下，用 DNA 聚合酶复 制出产物 DNA。PCR 反应应用以上的基本过程，分别在待复制的已知序列 DNA 分 子两端各设计一条引物，其中在 DNA 5’端的引物（Pl）对应于上链 DNA 单链的序列， 3’端的引物（P2）对应于下链 DNA 单链的序列，Pl 和 P2 按 5'→3'方向相向配置。在 含有引物、DNA 合成底物 dNTPs（dATP、dCTP、dGTP、dTTP 四种脱氧核糖核苷 酸等摩尔数混合物）的缓冲液中，通过高温变性，使双链 DNA 变成单链 DNA 模板， 降低温度复性，使引物与模板 DNA 配对，利用 DNA 聚合酶便可合成产物 DNA。引 物和 dNTPs 过量，则在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和 DNA 合成这一 循环，使产物 DNA 重复合成，并且在重复过程中，前一循环的产物 DNA 可作为后 一循环的模板 DNA 参与 DNA 的合成，使产物 DNA 的量按 2 n 方式扩增，所以这一 反应称为聚合酶链式扩增反应。理论上如果引物及 dNTP 的量能够满足，则这一过程 可无限重复，使模板 DNA 无限扩增。PCR 反应使几个 DNA 模板分子通过数小时扩
《生物技术制药》实验指导增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗诊断中亦体现出极大的应用价值。常规PCR反应用于已知DNA序列的扩增，反应循环数为25~35，变性温度为94℃，复性温度为37℃~55℃，合成延伸温度为72℃，DNA聚合酶为Taqg酶（可耐受95℃左右的高温而不失活），DNA扩增倍数为10°~10。引物的设计在PCR反应中极为重要。要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15~25个核苷酸；②CG含量为40%~60%；③Tm值高于55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)计算】；④引物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于70%；③两条引物间配对碱基数小于5个；③引物自身配对（特别是在引物的3端）形成的茎环结构，茎的碱基对数不大于3。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。【实验材料和试剂】(一）)试剂Immol/LdATP1 : 4×dNTP :lmmol/LdCTPImmol/LdGTPImmol/LdTTP2.Taq酶:5U/13.模板DNA：0.g/ 14：引物:PI：5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3P2 : 5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3引物溶液浓度：50nmoI/L24
《生物技术制药》实验指导 24 增后增加到百万倍以上，因此能用微量样品获取目的基因，同时也完成了基因在体外 的克隆，成为分子生物学及基因工程中极为有用的研究手段。另外在医学研究和医疗 诊断中亦体现出极大的应用价值。 常规 PCR 反应用于已知 DNA 序列的扩增，反应循环数为 25～35，变性温度为 94℃，复性温度为 37℃～55℃，合成延伸温度为 72℃，DNA 聚合酶为 Taq 酶（可耐 受 95℃左右的高温而不失活），DNA 扩增倍数为 106～109。 引物的设计在 PCR 反应中极为重要。要保证 PCR 反应能准确、特异、有效地对 模板 DNA 进行扩增，通常引物设计要遵守以下几条原则：①引物长度：15~25 个核 苷酸；②CG 含量为 40%~60%；③Tm 值高于 55℃[Tm=4(C+G)+2(A+T)计算]；④引 物与模板非特异性配对位点的碱基配对率小于 70%；⑤两条引物间配对碱基数小于 5 个；⑥引物自身配对（特别是在引物的 3'端）形成的茎环结构，茎的碱基对数不大于 3。由于影响引物的设计的因素比较多，所以常常利用计算机来辅助设计。 【实验材料和试剂】 （一）试剂 1．4×dNTP： lmmol/L dATP lmmol/L dCTP lmmol/L dGTP lmmol/L dTTP 2．Taq 酶： 3．模板 DNA： 4．引物：Pl： 5'-TTCCATATGCCTACTTCAAGTTCT-3' P2：5'-ACCTAAGCTTGCTTCAAGTTAGTGT-3' 引物溶液浓度：50nmoI/L
《生物技术制药》实验指导(二)器血0.5ml薄壁Eppendorf管（三）仪器PCR自动扩增仪、离心机、微量注射器、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、透射紫外观察仪。【实验步骤】（一）准备PCR反应溶液1.取薄壁0.5mlEppendorf管一只，用微量注射器按以下顺序分别加入各试剂。10x缓冲液10 11014×dNTP引物 PI1111引物 P2模板DNA11Taq酶1 1加无菌双蒸馏水至10012.用手指轻弹Eppendorf管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底。3.加石蜡油501封住溶液表面。（二）PCR扩增反应将加好样品的Eppendorf管插在PCR自动扩增仪样品板上，95℃10分钟，使模板充分变性。然后按以下步骤在PCR自动扩增仪中进行反应，25~35个循环。93℃30秒25
《生物技术制药》实验指导 25 （二）器皿 0.5ml 薄壁 Eppendorf 管 （三）仪器 PCR 自动扩增仪、离心机、微量注射器、微量移液器、电泳仪、水平电泳槽、 透射紫外观察仪。 【实验步骤】 （一）准备 PCR 反应溶液 1．取薄壁 0.5ml Eppendorf 管一只，用微量注射器按以下顺序分别加入各试剂。 10×缓冲液 10 l 4×dNTP 引物 Pl 引物 P2 模板 Taq 酶 加无菌双蒸馏水至 2．用手指轻弹 Eppendorf 管底部，使溶液混匀。在台式离心机中离心 2 秒以集 中溶液于管底。 3．加石蜡油 50 l 封住溶液表面。 （二） PCR 扩增反应 将加好样品的 Eppendorf 管插在 PCR 自动扩增仪样品板上，95℃10 分钟，使模 板充分变性。然后按以下步骤在 PCR 自动扩增仪中进行反应，25～35 个循环。 93℃ 30 秒
《生物技术制药》实验指导55℃45秒72℃45秒反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用。（三）结果检测本实验PCR扩增的产物DNA片段长度为609bp，适合于1.0%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。具体操作方法见实验三。【提示】（一）引物设计由于PCR反应在实用中，模板DNA往往来源于组织和细胞，所以样品的DNA背景十分复杂（如一个人的细胞含有30亿对碱基的DNA）设计引物时不能通过检索这些DNA的背景资料来得到特异性的引物，也就是说设计的引物不能完全排除与背景DNA还存在有大部份配对或完全配对的位点，尽量使设计的引物符合设计的般原则，将可通过控制PCR反应条件来减少非特异性配对位点对反应的干扰。（二）非特异扩增产物的出现当扩增的DNA产物不止一种时，通常与以下几种情况有关：①背景DNA有与引物同源性高的其它位点。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对或二条引物对扩增的产物DNA再做PCP扩增；②退火温度太低。引物与模板的配对是一个动态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。退火温度太低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而不解离下来，这种不正确的配对，进入PCR反应过程就可扩增出非特异的产物DNA。提高反应的退火温度（有时此Tm值高出几度）将可改善结果；③过量的酶、引物和dNTP可使PCR反应造成混乱，强行扩增出非特异产物DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决。6
《生物技术制药》实验指导 26 55℃ 45 秒 72℃ 45 秒 反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用。 （三）结果检测 本实验 PCR 扩增的产物 DNA 片段长度为 609bp，适合于 1.0%琼脂糖凝胶中进 行电泳检测。具体操作方法见实验三。 【提示】 （一）引物设计 由于 PCR 反应在实用中，模板 DNA 往往来源于组织和细胞，所以样品的 DNA 背景十分复杂（如一个人的细胞含有 30 亿对碱基的 DNA）。设计引物时不能通过检 索这些 DNA 的背景资料来得到特异性的引物，也就是说设计的引物不能完全排除与 背景 DNA 还存在有大部份配对或完全配对的位点，尽量使设计的引物符合设计的一 般原则，将可通过控制 PCR 反应条件来减少非特异性配对位点对反应的干扰。 （二）非特异扩增产物的出现 当扩增的 DNA 产物不止一种时，通常与以下几种情况有关：①背景 DNA 有与 引物同源性高的其它位点。可通过在两个引物的内侧序列上再使用另外一对或二条引 物对扩增的产物 DNA 再做 PCP 扩增；②退火温度太低。引物与模板的配对是一个动 态过程，分子的热运动使引物与模板结合与解离而达到最佳配对位点上。退火温度太 低，造成引物与模板的非特异性位点部分配对而不解离下来，这种不正确的配对，进 入 PCR 反应过程就可扩增出非特异的产物 DNA。提高反应的退火温度（有时此 Tm 值高出几度）将可改善结果；③过量的酶、引物和 dNTP 可使 PCR 反应造成混乱， 强行扩增出非特异产物 DNA，适当降低这些试剂的量有助于问题的解决
《生物技术制药》实验指导（三）PCR反应扩增不出DNA条带在实验中偶而会出现这类情况，一般有以下几种原因：①引物的3端与5'端书写错误，造成引物合成的错误。此时应重新合成引物；②引物溶液反复冻融或污染了DNA酶类，造成引物降解。换一份引物可解决该类间题；③模板DNA制备时模板已降解。这时应尽量找一些指示指标来检测模板质量；④Taq酶有失活或有杂酶污染重新换一份酶；③缓冲液条件不当。各类PCR反应要求的条件并不完全一致，其中Mg+离子的浓度对Taq的活性影响尤为明显，Mg*+浓度直接影响到DNA扩增的特异性和扩增DNA的产率，在反应体系中，由于DNA模板、引物、四种dNTP的磷酸基团，以及引物、模板原液中的EDTA等螯合剂都要结合Mg2，因此合适的Mg*浓度至关重要。一般的情况下过量的Mg*会导致酶催化非特异性产物的扩增，而Mg浓度过低，又会影响Taq酶的活性，使产物DNA量降低。为了选择到最佳的反应条件，在实验前，可设置在一定浓度的模板DNA、引物、dNTP和循环参数下，用不同浓度（如0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、..5.0mmol/L）Mg进行预实验。在确定大概浓度后，可在该浓度上以0.2mmol/L增减。10x缓冲液中用100mmol/LTris-HCl是一种双极性离子缓冲液，以维持合适的pH的缓冲能力，10x缓冲液中的100mmol/LKCI是有利于引物的退火，但是过高的KCI将抑制酶的活性。缓冲液中的明胶、TritonX-100是为了稳定酶不变性失活,有的反应中加入100g/ml的小牛血清白蛋白或0.05%Tween20，以及5mmol/LDTT，都是酶的保护剂。50%甘油是为使酶保存于-20℃时，不因结冰而失活。这些酶的保护剂如果浓度过高，特别是质量欠佳时，往往都抑制酶在反应中的活性，在使用时应特别注意。在反应体系中如果加入10%的DMSO（二甲亚砜）可以减少二级结构的形成，增加反应的特异性，但它对酶的活性也有少许抑制作用。2
《生物技术制药》实验指导 27 （三）PCR 反应扩增不出 DNA 条带 在实验中偶而会出现这类情况，一般有以下几种原因：①引物的 3'端与 5'端书写 错误，造成引物合成的错误。此时应重新合成引物；②引物溶液反复冻融或污染了 DNA 酶类，造成引物降解。换一份引物可解决该类间题；③模板 DNA 制备时模板己 降解。这时应尽量找一些指示指标来检测模板质量；④Taq 酶有失活或有杂酶污染。 重新换一份酶；⑤缓冲液条件不当。各类 PCR 反应要求的条件并不完全一致，其中 Mg2+离子的浓度对 Taq 的活性影响尤为明显，Mg2+浓度直接影响到 DNA 扩增的特异 性和扩增 DNA 的产率，在反应体系中，由于 DNA 模板、引物、四种 dNTP 的磷酸 基团，以及引物、模板原液中的 EDTA 等螯合剂都要结合 Mg2+，因此合适的 Mg2+浓 度至关重要。一般的情况下，过量的 Mg2+会导致酶催化非特异性产物的扩增，而 Mg2+ 浓度过低，又会影响 Taq 酶的活性，使产物 DNA 量降低。为了选择到最佳的反应条 件，在实验前，可设置在一定浓度的模板 DNA、引物、dNTP 和循环参数下，用不同 浓度（如 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、.5.0mmol/L）Mg2+进行预实验。在确定大 概浓度后，可在该浓度上以 0.2mmol/L 增减。10×缓冲液中用 100mmol/L Tris-HCl 是 一种双极性离子缓冲液，以维持合适的 pH 的缓冲能力，10×缓冲液中的 100mmol/L KCl 是有利于引物的退火，但是过高的 KCl 将抑制酶的活性。缓冲液中的明胶、 TritonX-l00 是为了稳定酶不变性失活，有的反应中加入 的小牛血清白蛋白 或 0.05%Tween20，以及 5 mmol/L DTT，都是酶的保护剂。50%甘油是为使酶保存于 -20℃时，不因结冰而失活。这些酶的保护剂如果浓度过高，特别是质量欠佳时，往 往都抑制酶在反应中的活性，在使用时应特别注意。在反应体系中如果加入 10%的 DMSO（二甲亚砜）可以减少二级结构的形成，增加反应的特异性，但它对酶的活性 也有少许抑制作用