第4章分子发光分析法 (Molecular Luminescence Analysis) 4.1分子荧光和磷光分析 (Molecular Fluorescence and Phosphorescence Analysis) 4.2化学发光分析 (Chemiluminescence Analysis) 分子发光包括荧光、磷光、化学发光,生物发光和散射光谱等。本章主要讨论前三种分子 发光分析 4.1分子荧光和磷光分析 (一)原理 1.荧光和磷光的产生 室温下,大多数分子处在基态的最低振动能层。处于基态的分子吸收能量(电能热能、化 学能或光能等)后被激发为激发态.激发态不稳定将很快衰变到基态。若返回到基态时伴随 着光子的辐射,这种现象称为“发光”。现在从分子结构理论来讨论荧光和磷光的产生机理 每个分子具有一系列严格分立的能级,称为电子能级,而每个电子能级中又包含一系列的 振动能层和转动能层,示意于图4.1.图中基态用So表示,第一电子激发单重态和第二电子激 发单重态分别用S1、S2表示,第一电子激发三重态和第二电子激发三重态分别用T、T2表示, =0、1、2,3…表示基态和激发态的振动能层 电子激发态的多重度用M=2s+1表示,S为电子自旋量子数的代数和,其数值为0或1 根据 Pauli不相容原理,分子中同一轨道所占据的两个电子必须具有相反的自旋方向,即自旋 配对。假如分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的,即s=0,分子的多重度M=1,该分子 体系便处于单重态,用符号S表示。大多数有机物分子的基态是处于单重态的。分子吸收能 量后,若电子在跃迁过程中不发生自旋方向的变化,这时分子处于激发的单重态,如图4.1中 的S1和S2。如果电子在跃迁过程中还伴随着自旋方向的改变,这时分子便具有两个自旋不配 对的电子,即s=1,分子的多重度M=3,分子处于激发的三重态,用符号T表示。处于分立轨 道上的非成对电子,平行自旋要比成对自旋更稳定些(洪特规则)因此三重态能级总是比相应 的单重态能级略低,如图4.1中的T1和T2 处在激发态的分子是不稳定的,它可能通过辐射跃迁和非辐射跃迁等去活化过程返回基 态,其中以速度最快,激发态寿命最短的途径占优势。有以下儿种基木的去活化过程 (1)振动弛豫当分子吸收光辐射后可能从基态的最低振动能层v=0)跃迁到激发态S 的较高的振动能层上去。然而,在液相或压力足够高的气相中分子问碰撞的几率很大激发态 分子可能将过剩的振动能量以热的形式传递给周的分子,而自身从Sn的高振动能层失活 到该电子能级的最低振动能层上,这一过程称为振动弛豫发生振动弛豫的时间为10-s数 84
单重态 三重态 振动弛豫 内转换 U=0 圭 Az a 外转换 激发 荧光(熄灭) 磷光振动范像 图4.1荧光和磷光体系能级图 量级。图4中各振动能级间的小箭头表示振动弛豫的情况 (2)荧光发射当分子处于单重激发态的最低振动能级时,去活化过程的一种形式是以 0-9~10-7左右的短时间内发射一个光子返回基态,这一过程称为荧光发射,。由于溶液中 振动弛豫效率很高,它在发射之前和发射之后都可能发生。因此、发射荧光的能量比分子所吸 收的能量要小,即荧光的特征波长比它所吸收的特征波长要长。根据 Kasha规则荧光多为 S1→S0跃迁 (3)内转换内转换指的是相同多重度等能态间的一种无辐射跃迁过程。当两个电子能 级的振动能层间有重叠时,则可能发生电子由高能层以无辐射跃迁方式跃迁到低能层的电子 激发态,如图4.1中S2和T2态的较低振动能层,与S1和T中的较高振动能层相重叠,重叠 的地方,两激发态间处于过渡性热平衡,低电子激发态通过振动耦合作用得到了累积。内转换 过程在10-3~10-"s时间内发生,它通常要比由高激发态直接发射光子的速度快得多.因 此如图4.1所示,分子最初无论在哪一个激发单重态,都能通过振动弛豫和内转换到达最低激 发单(或三)重态的最低振动能层上 (4)外转换激发分子通过与溶剂或其他溶质间的相互作用和能量转换而使荧光或磷光 强度减弱甚至消失的过程称外转换。这一现象称为“熄灭”或“猝灭” 由较低的激发单重态及较低的三重态的非辐射跃迁可包含外转换,也可包含内转换 (5)系间跨越系间跨越指的是不同多重度状态间的一种无辐射跃迁过程,它涉及受激 电子自旋状态的改变。如S1→T1,使原来两个自旋配对的电子不再配对。这种跃迁是禁阻 85
的,但如果两个电子能态的振动能层有较大的重叠时,如图4中激发单重态S1的最低振动 能层与激发三重态T的较高振动能层重叠,则可能通过白旋-轨道耦合等作用使S1态转入 T1态的某一振动能层 (6)磷光发射从单重态到三重态的分子系问跨越跃迁发生后,接着发生快速的振动弛 豫而到达三重态的最低振动能层上,当没有其他过程同它竞争时,在10-4~10s左右时间内 跃迁回基态而发生磷光。由此可见,荧光与磷光的根本区别是:荧光是由激发单重态最低振动 能层至基态各振动能层的跃迁产生的,而磷光是由激发三重态的最低振动能层至基态各振动 能层间跃迁产生的 2.激发光谱和发射光谱 任何荧光(磷光)化合物都具有两个特征光谱激发光谱和发射光谱。它们是荧光(磷光) 定性和定量分析的基本参数和依据., (1)激发光谱荧光和磷光都是光致发光,因此必须选择合适的激发光波长,这可从它们 的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时,选择荧光(磷光)的最大发射波长为测量波长 改变激发光的波长,测量荧光强度的变化。以激发光波长为横坐标,荧光强度为纵坐标作图, 即得到荧光(磷光)化合物的激发光谱.激发光谱的形状与吸收光谱的形状极为相似,经校正 后的真实激发光谱与吸收光谱不仅形状相同,而且波长位置也一样,这是因为物质分子吸收 能量的过程就是激发过程。 (2)发射光谱简称荧(磷)光光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处,然后扫描 发射波长,测定不同发射波长处的荧(磷)光强度,即得到 荧(磷)光发射光谱。图42为茶的激发光谱、荧光发射光 谱和磷光发射光谱。荧光发射光谱显示了若干普遍的 特性。 i) Stokes位移.在溶液中,分子荧光的发射相对于 吸收位移到较长的波长,称为 Stokes位移。这是由于受 激分子通过振动弛豫而失去振动能,也由于溶液中溶剂分 子与受激分子的碰撞,也会有能量的损失。因此在激发和 发射之间产生了能量损失 (i)荧光发射光谱的形状与激发波长无关.如图4.1 所示,引起物质分子激发的波长是λ1和入2,但荧光的波长 图42莱的激发光谱(I)荧光都是2这是因为分子吸收了不同能量的光子可以由基 (Ⅱ)和磷光(亚)光谱 态激发到几个不同的电子激发态,而具有几个吸收带。由 于较高激发态通过内转换及振动弛豫回到第一电子激发态的几率是很高的,远大于由高 能激发态直接发射光子的速度,故在荧光发射时,不论用哪一个波长的光辐射激发,电子都从 第一电子激发态的最低振动能层返回到基态的各个振动能层,所以荧光发射光谱与激发波长 无关 〔i)镜像规则。通常荧光发射光谱和它的吸收光谱镜像对称关系,如图43所示的 蒽的荧光光谱和吸收光谱那样(不延伸到250nm的最大吸收处)。 吸收光谱是物质分子由基态激发至第一电子激发态的各振动能层所致,其形状决定于第 电子激发态中各振动能层的分布情况。荧光光谱是激发分子从第一电子激发态的最低振动
吸光 吸光 荧光 30 图43蒽的乙醇溶液的荧光光谱(右)和吸收光谙〔左) 能层回到基态中各不同能层所致,所以荧光光谱的形状决定于基态中各振动能层的分布情 况.基态中振动能层的分布和第一电子激发态中振动能层的分布的情况是类似的,因此荧光 光谱的形状和吸收光谱极为相似。由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发态各个振动能层 的吸收过程中,振动能层越高两个能层之间的能量差越大,即激发所需能量越高,所以吸收峰 的波长将越短.反之,由第一电子激发态的最低振动能层降落到基态各个振动能层的荧光发 射过程中,基态振动能层越高,两个能层之间的 能量差越小,荧光峰的波长越长。另外,也可从 位能曲线解释镜像规则(见图44).由于光吸 收是在大约10s的短时间内发生的,在如此啊 短的时间内原子核没有明显的位移,即电子与 核之间的位置没有发生变化.其结果是,假如 在吸收过程中,基态的零振动能层与激发态的 第二振动能层之间的跃迁几率最大,那么在荧 离 波长 光发射过程中,其相反跃迁的儿率也应该最 图44镜像规则 大.也就是说,吸收和发射的能量都最大 3.荧光和分子结构的关系 分子产生荧光必须具备两个条件:(i)分子必须具有与所照射的辐射频率相适应的结构, 才能吸收激发光;(i)吸收了与其本身特征频率相同的能量之后,必须具有一定的荧光量子 产率 荧光量子产率(q)也称荧光效率或量子效率,它表示物质发射荧光的能力,通常用下式 表示 =发射的光量子数 吸收的光量子数 许多吸光物质并不能发射荧光,因为在激发态分子释放激发能的过程中除荧光发射外,还有许 多上节所述的辐射和非辐射跃迁过程与之竞争。荧光的量子产率与上述每一个过程的速率常 数有关。可以数学式表示如下 式中kr为荧光发射过程的速率常数∑k为其他有关过程的速率常数的总和,从上式可知
凡是能使k值升高而使其他k值降低的因素,都可增强荧光。一般说米,kr主要决定于化学 结构而∑k则主要决定于化学环境同时也与化学结构有关。磷光的量子产率与荧光相 似。下面就讨论什么样结构的物质会发生荧光以及化学结构上的改变对其荧光强度和荧光光 谱的影响 1)跃迁类型实验表明,大多数荧光化合物都是由π→兀*或n→π*跃迁激发,然后经 过振动弛豫或其他无辐射跃迁,再发生π*→π或π*→n跃迁而产生荧光,其中π*→兀跃迁 的量子效率较高。这是由于兀→π*跃迁的摩尔吸光系数比n→π*跃迁的大100~1000倍, r→*跃迁的寿命(107-103)比n兀*跃迁的寿命(10-5103)短,因此kr值较大; 此外,在π*→兀跃迁过程中,通过系间跨越跃迁至三重态的速率常数也较小,也有利于荧光的 发射。 (2)共轭效应含有→π*跃迁能级的芳香族化合物的荧光最强,这种体系中的兀电 子共轭度越大,则π电子非定域性越大,越易被激发荧光也就越易发生,而且荧光光谱将向长 波移动。所以绝大多数能发生荧光的物质含有芳香环或杂环;除少数高共轭体系外,能发生荧 光的脂肪族和脂环族化合物极少。任何有利于提高x电子共轭度的结构政变,都将提高荧光 效率,并使荧光波长向长波方向移动。例如表4.1和表4.2所列的对苯基化、间苯基化和乙 烯化作用都将增加苯的荧光强度,并使荧光光谱红移 41对苯基化和间苯基化作用对荧光效率以及荧光波长的影响 化合物(在环已烷中) a/nm 0.07 联苯 316 对-联三萃 0.93 对-联四苯 0.89 366 1,3,5-三苯基苯 0.27 表4,2乙烯化作用对荧光效率以及荧光波长的影响 化合物 a/nm 联苯 0.18 4-乙烯基联苯 061 蒽 0.36 9-乙烯基蒽 0.76 432 3)刚性平面结构实验发现多数具有刚性平面结构的有机分子具有强烈的荧光,因为 这种结构可以减少分子的振动使分子与溶剂或其他溶质分子的相互作用减小,也就减少了碰 撞去活的可能性。 试比较荧光素和酚酞的结构,尽管它们十分相似,但荧光素在溶液中有很强的荧光,而酚 酞却没有.这主要是荧光素分子中的氧桥使其具有刚性平面结构,又如芴和联苯在同样条件 下其量子效率分别为≈1和0.18,芴中的亚甲基使分子的刚性增加导致两者在荧光性质上显 著的差别