5.最后得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加1滴1/5000詹纳斯绿B溶液。 垫鱼10min。 6.加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见线 粒体被染成蓝绿色，呈球形、小棒状或哑铃状。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻：尽可能充分玻碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 二、植物线粒体的分离制备 1,玉米种子用20%次氯酸钠溶液浸泡10min消毒，清水冲洗30mim,再用清水浸泡 12“催芽。然后将种子均匀铺放在发芽盒中，覆盖一层湿润的沙子，保持湿度，置于温箱 28℃暗培养35d,得到黄化苗。 2.取黄化苗样品1g,加入3ml预冷的线粒体分离介质，在瓷研体内快速研磨匀浆。 3.取匀浆液1.5ml于1.5ml的EP管中，置于冷冻离心机中，以2500pm离心10min 4.取1.0ml上清转入新EP管中，置于冷冻离心机中，以10000rpm离心10min, 弃上清，得到沉淀即为线粒体。 5.加入预冷的线粒体分离介质1.5ml,摇匀洗涤后，10000pm离心5min,弃上清 6.将得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加1滴1V5000詹纳斯绿B溶液， 染色10min。 7.加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见 线粒体被染成蓝绿色，呈圆形颗粒。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻：尽可能充分破碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 【实验结果与思考题】 1.描述两种线粒体装片的观察结果，根据你的实验结果，你认为所分离的线粒体的纯 度如何？ 2.线粒体提取分离过程中，为什么要在0~4℃进行？ 3.要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问 题？
5.最后得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加 1 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 溶液， 染色 10 min。 6.加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见线 粒体被染成蓝绿色，呈球形、小棒状或哑铃状。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 二、植物线粒体的分离制备 1. 玉米种子用 20%次氯酸钠溶液浸泡 10 min 消毒，清水冲洗 30min，再用清水浸泡 12 hr 催芽。然后将种子均匀铺放在发芽盒中，覆盖一层湿润的沙子，保持湿度，置于温箱 28℃暗培养 3~5 d，得到黄化苗。 2. 取黄化苗样品 1 g，加入 3 ml 预冷的线粒体分离介质，在瓷研钵内快速研磨匀浆。 3. 取匀浆液 1.5 ml 于 1.5 ml 的 EP 管中，置于冷冻离心机中，以 2500 rpm 离心 10 min。 4. 取 1.0 ml 上清转入新 EP 管中，置于冷冻离心机中，以 10 000 rpm 离心 10 min， 弃上清，得到沉淀即为线粒体。 5. 加入预冷的线粒体分离介质 1.5 ml，摇匀洗涤后，10 000 rpm 离心 5 min，弃上清。 6. 将得到的线粒体沉淀取少量，点在载玻片上，滴加 1 滴 1/5000 詹纳斯绿 B 溶液， 染色 10 min。 7. 加盖玻片，压片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余水分。光学显微镜下观察，可见 线粒体被染成蓝绿色，呈圆形颗粒。 注意事项：如果使用非冷冻控温的离心机，应注意使样品保持冷冻；尽可能充分破碎组 织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长。 【实验结果与思考题】 1. 描述两种线粒体装片的观察结果，根据你的实验结果，你认为所分离的线粒体的纯 度如何? 2. 线粒体提取分离过程中，为什么要在 0～4℃进行？ 3. 要获得高活性的线粒体，在线粒体提取、分离和活性鉴定的过程中需注意哪些问 题？ 11
实验五植物液泡的活体染色与观察 【实验目的】 掌握植物液泡活体染色的原理和技术 【实验原理】 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但又无毒害的一种染色方法。由于碱 性染料的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离 子或阴离子，因此它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来，可以显示出活细胞内的 某种天然结构存在的真实性，面不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细 胞的死亡。 活体染色可分为体内活染和体外活染两种类型。体内活染是将染料溶液以胶体状态注入 动植物体内，染料的颗粒固定、聚集在细胞内的特殊部位，达到被识别观察的目的。体外活 染又称为超活染色，该方法从活的动、植物体内分离出部分细胞或组织，以染料溶液侵染， 染料被选择性地定位在活细胞的某种结构上而显色。活体染色技术可用来研究生活状态下的 细胞结构和生理、病理状态。 液泡(vacuole))是植物细胞质中的泡状结构，是植物细胞中特有的细胞器，在成熟的活 的植物细胞中经常都有一个大的充满液体的中央液泡，可占据整个细胞体积的90%，是在细 胞生长和发有过程中由小的液泡融合而成的。液泡的表面有液泡膜，液泡内有细跑液，含有 无机盐、氨基酸、糖类以及各种色素等代谢物，甚至还含有有毒化合物，并处于高渗状态。 因此，它对细胞内的环境起若着重要的调节作用，可以使细胞保持一定的渗透压，保持膨张的 状态。 中性红(neutral red)是一种弱碱性plH指示剂，变 色范围在pH6.48.0之间（由红变黄）。植物的活细胞 能大量吸收中性红并向液泡中转移，由于液泡一般 情况下呈酸性反应，进入液泡的中性红可解离出大 量阳离子而呈现樱桃红色，原生质和细胞壁一般不 着色：死细胞由于原生质变性凝固，液泡失去功能。 用中性红染色时，中性红不能进入液泡，中性红的 阳离子反而与带有一定负电荷的原生质及细胞核结 合，而使原生质与细胞核染色。因此，中性红是液 泡的特殊染色剂，只将液泡染成红色，在细胞处于 图5液泡的中性红染色 生活状态时，细胞质和细胞核不被中性红染色。 【材料、器具与试剂】 (一)材料：洋葱鳞茎，小麦根尖，玉米根尖，大豆根尖。 (二)器具：普通光学显微镜、恒温水浴锅，天平，解剖盘、剪刀、镊子、解剖刀、吸管 载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸，量筒，烧杯
实验五 植物液泡的活体染色与观察 【实验目的】 掌握植物液泡活体染色的原理和技术。 【实验原理】 活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色，但又无毒害的一种染色方法。由于碱 性染料的胶粒表面带有阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染部分本身具有阳离 子或阴离子，因此它们彼此之间发生吸引作用，染料就被堆积下来，可以显示出活细胞内的 某种天然结构存在的真实性，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以引致细 胞的死亡。 活体染色可分为体内活染和体外活染两种类型。体内活染是将染料溶液以胶体状态注入 动植物体内，染料的颗粒固定、聚集在细胞内的特殊部位，达到被识别观察的目的。体外活 染又称为超活染色，该方法从活的动、植物体内分离出部分细胞或组织，以染料溶液侵染， 染料被选择性地定位在活细胞的某种结构上而显色。活体染色技术可用来研究生活状态下的 细胞结构和生理、病理状态。 液泡(vacuole) 是植物细胞质中的泡状结构，是植物细胞中特有的细胞器，在成熟的活 的植物细胞中经常都有一个大的充满液体的中央液泡，可占据整个细胞体积的90％，是在细 胞生长和发育过程中由小的液泡融合而成的。液泡的表面有液泡膜，液泡内有细胞液，含有 无机盐、氨基酸、糖类以及各种色素等代谢物，甚至还含有有毒化合物，并处于高渗状态。 因此，它对细胞内的环境起着重要的调节作用，可以使细胞保持一定的渗透压，保持膨胀的 状态。 中性红(neutral red)是一种弱碱性pH指示剂，变 色范围在pH6.4~8.0之间(由红变黄)。植物的活细胞 能大量吸收中性红并向液泡中转移，由于液泡一般 情况下呈酸性反应，进入液泡的中性红可解离出大 量阳离子而呈现樱桃红色，原生质和细胞壁一般不 着色；死细胞由于原生质变性凝固，液泡失去功能， 用中性红染色时，中性红不能进入液泡，中性红的 阳离子反而与带有一定负电荷的原生质及细胞核结 合，而使原生质与细胞核染色。因此，中性红是液 泡的特殊染色剂，只将液泡染成红色，在细胞处于 生活状态时，细胞质和细胞核不被中性红染色。 图 5 液泡的中性红染色 【材料、器具与试剂】 （一）材料：洋葱鳞茎，小麦根尖，玉米根尖，大豆根尖。 （二）器具：普通光学显微镜、恒温水浴锅，天平，解剖盘、剪刀、镊子、解剖刀、吸管、 载玻片、盖玻片、擦镜纸、吸水纸，量筒，烧杯。 12
(三)试剂： 1Ring©r溶液：氯化钠8.50g,氯化钙0.03g,氯化钾0.25g,蒸馏水100ml溶解定容。 2.1%中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50 ml Ringer溶液，稍加热(30-40C)使之很快溶 解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。 3.1/3000中性红溶液：临用前，取已配制的1%中性红溶液2ml,加入58 ml Ringeri溶液混 匀，装入棕色瓶备用。 【实验步骤】 1.材料培养：实验前，把小麦、玉米或者大豆的种子用清水浸泡12加，然后放在含有湿 润沙子的盒子中培养，使其发芽生根。待根长到2cm以上时，可用于实验。 2.取培养得到的根系的根尖（约12cm),用刀片小心纵切一下。 3将纵切后的根尖放到干净的载玻片上，滴1滴1/3000中性红溶液，染色5-10min。 4.用吸水纸吸去多余染液，滴1滴Ringeri溶液，盖上盖玻片，并用慑子轻压盖玻片，将根 尖压扁铺展，使其便于观察。 5.置显微镜下观察。在高倍镜下，首先观察根尖生长点的细胞，可见细胞质中有很多大 小不等的被染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后由生长点向伸长区观察 在一些已分化长大的细胞内，液泡的体积增大，数目变少，染色较浅。最后观察成熟区细胞， 一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分体积，将细胞核挤到细胞一侧贴近细 胞壁处。 【实验结果与思考题】 1.绘图表示根尖不同部位液泡的形态和分布。 2简述液泡中性红活体染色的原理。 3.小麦或黄豆根尖经中性红染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延 长区细胞中液泡数量变少，染色浅？
（三）试剂： 1.Ringer溶液：氯化钠 8.50g，氯化钙 0.03g，氯化钾 0.25g，蒸馏水100 ml溶解定容。 2.1%中性红溶液：称取0.5 g中性红溶于50 ml Ringer溶液，稍加热(30~40℃)使之很快溶 解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。 3.1/3000中性红溶液：临用前，取已配制的1%中性红溶液2 ml，加入58 ml Ringer溶液混 匀，装入棕色瓶备用。 【实验步骤】 1.材料培养：实验前，把小麦、玉米或者大豆的种子用清水浸泡12 hr，然后放在含有湿 润沙子的盒子中培养，使其发芽生根。待根长到2 cm以上时，可用于实验。 2.取培养得到的根系的根尖（约1~2 cm），用刀片小心纵切一下。 3.将纵切后的根尖放到干净的载玻片上，滴1滴1/3000中性红溶液，染色5~10 min。 4.用吸水纸吸去多余染液，滴1滴Ringer溶液，盖上盖玻片，并用镊子轻压盖玻片，将根 尖压扁铺展，使其便于观察。 5.置显微镜下观察。在高倍镜下，首先观察根尖生长点的细胞，可见细胞质中有很多大 小不等的被染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后由生长点向伸长区观察， 在一些已分化长大的细胞内，液泡的体积增大，数目变少，染色较浅。最后观察成熟区细胞， 一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分体积，将细胞核挤到细胞一侧贴近细 胞壁处。 【实验结果与思考题】 1.绘图表示根尖不同部位液泡的形态和分布。 2.简述液泡中性红活体染色的原理。 3.小麦或黄豆根尖经中性红染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，延 长区细胞中液泡数量变少，染色浅? 13
实验六叶绿体的分离与荧光观察 【实验目的】 1.了解叶绿体分离的一般原理和方法。 2熟悉应用荧光显微镜观察叶绿体的荧光现象。 【实验原理】 差速离心(difertifuio)是利用不同物质颗粒沉降系数的差别，由低速向高 速离心时，各种沉降系数不同的颗粒可先后分批沉淀下来，达到分离的目的。颗粒的沉降系 数取决于颗粒的大小、形状和密度，也同高心力以及悬浮介质的粘度有关。沉降系数差别在 一个或几个数量级的颗粒，可以用差速离心法分离，该方法简单，但分辨率不高，沉淀系数 在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。采用差 速离心方法，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，可用于分离不同大小的细胞和细 胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、叶绿体、线粒体、溶酶体与过氧化物酶 体、内质网与高基体、最后为核蛋白体和大分子。通过差速离心可对叶绿体进行分离制备。 叶绿体(chloroplast)是绿色植物细胞所特有的能量转换细胞器。一般呈椭球形，长径 5~10um,短径2~4um,厚2-3um。有双层被膜与胞质分开，内有片层膜，含叶绿素，光合 作用就在片层膜上进行.高等植物的叶肉细胞一般含50~200个叶绿体，可占细胞质的40% 叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被 (chloroplast envelope)、类囊体(thylakoid)和基质(stroma)3部分组成。利用低速离心 机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液(0.35M氯化钠或0.4M蔗糖溶液)中进行，目的是 防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。 外膜 内膜 叶绿体基粒 类囊体 基质 图6叶绿体的结构模式图 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样 品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定
实验六 叶绿体的分离与荧光观察 【实验目的】 1.了解叶绿体分离的一般原理和方法。 2.熟悉应用荧光显微镜观察叶绿体的荧光现象。 【实验原理】 差速离心(differential centrifugation) 是利用不同物质颗粒沉降系数的差别，由低速向高 速离心时，各种沉降系数不同的颗粒可先后分批沉淀下来，达到分离的目的。颗粒的沉降系 数取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的粘度有关。沉降系数差别在 一个或几个数量级的颗粒，可以用差速离心法分离，该方法简单，但分辨率不高，沉淀系数 在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。采用差 速离心方法，在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，可用于分离不同大小的细胞和细 胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、叶绿体、线粒体、溶酶体与过氧化物酶 体、内质网与高基体、最后为核蛋白体和大分子。通过差速离心可对叶绿体进行分离制备。 叶绿体（chloroplast）是绿色植物细胞所特有的能量转换细胞器。一般呈椭球形，长径 5~10um，短径 2~4um，厚 2~3um。有双层被膜与胞质分开，内有片层膜，含叶绿素，光合 作用就在片层膜上进行。高等植物的叶肉细胞一般含 50～200 个叶绿体，可占细胞质的 40%， 叶绿体的数目因物种细胞类型，生态环境，生理状态而有所不同。叶绿体由叶绿体外被 （chloroplast envelope）、类囊体（thylakoid）和基质（stroma）3 部分组成。 利用低速离心 机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35M 氯化钠或 0.4M 蔗糖溶液）中进行，目的是 防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。 图 6 叶绿体的结构模式图 荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜，其基本原理是利用一定波长的激发光对样 品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定 14
量观察检测。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件（如荧光光源、激发 滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光是某些物质在一定短波长的光（如 紫外光)的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，放射出的比照射光波长更长 的光（如可见光）。荧光物质都是吸收短波长的光而发出较长波长的光，比如DAPI吸收禁 色光发出蓝色荧光，绿色荧光蛋白、FTC吸收蓝色光发出绿色荧光，CY3、PI吸收绿色光 发出红色荧光，CY5吸收红色光发出波长为670纳米的红外线。荧光必须是在有激发光照 射的情况下才会有，若停止供能，荧光现象立即停止。荧光可分为直接荧光和间接荧光两种。 直接荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光，又称为自发荧光，如 植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。间接荧光：有些生物组织经紫 外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，又称为次生荧光 如吖啶橙，DAPI 吖啶橙(Acridine Orange,.AO)是一种荧光色素，其激发滤光片波长48Snm,阻断滤 光片波长S15nm。它与细胞中DNA和 RNA结合量存在差别，可发出不同颜 色的荧光（即着色特异性），这是由 于DNA是个高度聚合物，吸收荧光物 质的位置较少，发绿色荧光，而RNA 聚合度低，能和荧光物质结合的位置 多，故发红色荧光。用0.01%吖啶橙 荧光染料对叶绿体进行染色，于荧光 显微镜下观察，可观察到叶绿体发橙 红色荧光。 图7普通光学显微镜下观察到的叶绿体 【材料、器具与试剂】 (一)材料：菠莱叶片 (二)器具：普通离心机，组织坞碎机，天平，荧光显微镜，普通光学显微镜，载玻片，盖 玻片，镊子，培养皿，滤纸，试管，试管架，滴管，无荧光载片，移液器，1.5ml离心管。 量筒，烧杯。 (三)试剂： 1.蒸馏水 2.0.35M氯化钠溶液：取2048g氯化钠，用蒸馏水溶解，定容至1L。 3.0.1%吖啶橙(acridine orange:)称取0.1g吖啶橙，加蒸馏水100ml溶解，作为母液贮 棕色瓶中，放冰箱备用。 4.0.01%吖啶橙((acridine orange):临用前，取1ml0.1%吖啶橙母液，加9ml蒸馏水， 混匀。 【实验步骤】
量观察检测。荧光显微镜的基本构造是由普通光学显微镜加上一些附件(如荧光光源、激发 滤片、双色束分离器和阻断滤片等)的基础上组成的。荧光是某些物质在一定短波长的光（如 紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，放射出的比照射光波长更长 的光（如可见光）。荧光物质都是吸收短波长的光而发出较长波长的光，比如 DAPI 吸收紫 色光发出蓝色荧光，绿色荧光蛋白、FITC 吸收蓝色光发出绿色荧光，CY3、PI 吸收绿色光 发出红色荧光，CY5 吸收红色光发出波长为 670 纳米的红外线。 荧光必须是在有激发光照 射的情况下才会有，若停止供能，荧光现象立即停止。荧光可分为直接荧光和间接荧光两种。 直接荧光：在生物的某些组织中，经紫外线照射后能直接发射出荧光，又称为自发荧光，如 植物组织中的叶绿素，经紫外线照射后，即可发出红色荧光。间接荧光：有些生物组织经紫 外线照射后，并不能发出荧光，但是当它吸收荧光染料后也可以产生荧光，又称为次生荧光， 如吖啶橙，DAPI。 吖啶橙（Acridine Orange，AO）是一种荧光色素，其激发滤光片波长 488nm，阻断滤 光片波长 515nm。它与细胞中 DNA 和 RNA 结合量存在差别，可发出不同颜 色的荧光（即着色特异性），这是由 于 DNA 是个高度聚合物，吸收荧光物 质的位置较少，发绿色荧光，而 RNA 聚合度低，能和荧光物质结合的位置 多，故发红色荧光。用 0.01%吖啶橙 荧光染料对叶绿体进行染色，于荧光 显微镜下观察，可观察到叶绿体发橙 红色荧光。 图 7 普通光学显微镜下观察到的叶绿体 【材料、器具与试剂】 （一）材料：菠菜叶片 （二）器具：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，普通光学显微镜，载玻片，盖 玻片，镊子，培养皿，滤纸，试管，试管架，滴管，无荧光载片，移液器，1.5 ml 离心管， 量筒，烧杯。 （三）试剂： 1. 蒸馏水 2. 0.35 M 氯化钠溶液：取 20.48 g 氯化钠，用蒸馏水溶解，定容至 1 L。 3. 0.1 %吖啶橙(acridine orange)：称取 0.1g吖啶橙，加蒸馏水 100 ml溶解，作为母液贮 棕色瓶中，放冰箱备用。 4. 0.01%吖啶橙(acridine orange)：临用前，取 1 ml 0.1 %吖啶橙母液，加 9 ml蒸馏水， 混匀。 【实验步骤】 15