《细胞生物学实验》部分 由汤华编写 2007年5月 目录 第二部分细胞生物学实验 2 实验一细胞大小的测量 实验二 细胞膜的卷流性 线粒体的活体染色与观察 实验四线粒体的分离制备与观察」 .9 实验五植物液泡的活体染色与观察。 12 实验六叶绿体的分离与荧光观察 14 实验七 细胞内过氧化物酶的观察 17 实验八 细胞内含物的观察 实验九细胞骨架的光学显微镜观察 9 .23 实验十植物原生质体分离和活性鉴定。 .26 实验十一聚乙二醇法诱导的细胞融合」 29 实哈+一细购中DNA的Felgn边图家 31 实验十三 DNA和RNA的甲基绿-派洛宁原位染色法 35 实验十四 植物染色体结构与Giemsa分带技术 37 实验十五染色体核仁组织区的银染法. .41 实验十六细陶温亡的拾测 44 实验十七染色体荧光原位杂交技术 47 附录1细胞生物学实验室守则 53 附录2细胞生物学染色技术 附录3生物绘图与临时装片知识 .57 附录4实验报告的书写 .59 参考资料 60
《细胞生物学实验》部分 由汤华编写 2007 年 5 月 目 录 第二部分 细胞生物学实验.2 实验一 细胞大小的测量.2 实验二 细胞膜的渗透性.5 实验三 线粒体的活体染色与观察.7 实验四 线粒体的分离制备与观察.9 实验五 植物液泡的活体染色与观察.12 实验六 叶绿体的分离与荧光观察.14 实验七 细胞内过氧化物酶的观察.17 实验八 细胞内含物的观察.19 实验九 细胞骨架的光学显微镜观察.23 实验十 植物原生质体分离和活性鉴定.26 实验十一 聚乙二醇法诱导的细胞融合.29 实验十二 细胞中DNA的Feulgen染色观察.31 实验十三 DNA和RNA的甲基绿-派洛宁原位染色法.35 实验十四 植物染色体结构与Giemsa分带技术.37 实验十五 染色体核仁组织区的银染法.41 实验十六 细胞凋亡的检测.44 实验十七 染色体荧光原位杂交技术.47 附录 1 细胞生物学实验室守则.53 附录 2 细胞生物学染色技术.55 附录 3 生物绘图与临时装片知识.57 附录 4 实验报告的书写.59 参考资料.60 1
第二部分细胞生物学实验 实验一细胞大小的测量 【实验目的】 1.学会测微尺的使用和计算方法。 2.学习和掌握测量细胞大小的基本方法。 【实验原理】 细胞长度、宽度、面积、体积的测量，是研究细胞生理活动和形态特点的重要手段。应 用显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测 量和运算，可得出细胞的大小。 0 102030 1020304050 图1目镜测微尺和镜台测微尺 目镜测微尺(ocular micrometer)是一块圆形玻片，在玻片中央把5mm长度刻成S0等 分，或把10mm长度刻成100等分，每5小格间有一长线相隔。测量时，将其放在接目镜 中的隔板上（此处正好与物镜放大的中间像重叠）来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不 同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜 测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下， 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 镜台测微尺(stage micrometer)是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将lmm等 分为100格，每格长10μm(即0.0lmm),是专门用来校正目镜测微尺每格长度的。 校正时，将镜台测微尺放在载物台上，镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大， 从镜台测微尺上得到的读数就是真实的尺寸大小。由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位 置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放 大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺， 换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量，即可得到细胞的大小
第二部分 细胞生物学实验 实验一 细胞大小的测量 【实验目的】 1.学会测微尺的使用和计算方法。 2.学习和掌握测量细胞大小的基本方法。 【实验原理】 细胞长度、宽度、面积、体积的测量，是研究细胞生理活动和形态特点的重要手段。应 用显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测 量和运算，可得出细胞的大小。 图 1 目镜测微尺和镜台测微尺 目镜测微尺（ocular micrometer）是一块圆形玻片，在玻片中央把 5mm 长度刻成 50 等 分，或把 10mm 长度刻成 100 等分，每 5 小格间有一长线相隔。测量时，将其放在接目镜 中的隔板上(此处正好与物镜放大的中间像重叠)来测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不 同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜 测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下， 目镜测微尺每小格所代表的相对长度。 镜台测微尺（stage micrometer）是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将 lmm 等 分为 100 格，每格长 l0μm（即 0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺每格长度的。 校正时，将镜台测微尺放在载物台上，镜台测微尺随着显微镜总放大倍数的放大而放大， 从镜台测微尺上得到的读数就是真实的尺寸大小。由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位 置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放 大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺， 换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量，即可得到细胞的大小。 2
表1目镜测微尺量测倍率比照表 物镜倍数目镜倍数一格单位(um) 4 10 25.0um 10 10 10.0um 20 10 5.0μm 4010 2.5um 100101.0um 【材料、器具与试剂】 (一)材料： 九里香，扶桑花，少花龙葵，南瓜，凤仙花的新鲜花朵的花粉粒，洋葱鳞茎，口腔上 皮细胞。 (二)器具： 目镜测微尺，镜台测微尺，光学显微镜，尖头镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，滴管 吸水纸，牙签，刀片。 (三)试剂： 蒸馏水，生理盐水，O.1M碘液 【实验内容及步骤】 (一)测微尺的操作方法 1卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上 透镜 2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使镜台测微尺刻度位于视野中央。 先用低倍物镜观察，调焦至看清镜台测微尺的刻度。 3.小心移动镜台测微尺，同时转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近，使两尺 左边的0点刻度线对齐，进一步靠近使直线接近重合，然后由左向右找出两尺另一次对齐 重合的直线。 4.记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长 度等于多少μm。(目镜测微尺和镜台测微尺两个重合点的距离越长，则所测得的结果越准 确) 目镜测微尺每格的长度=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数×10”m 2 3 山山w山山山 0.0 10.102030.40.50.607 08 图2目镜测微尺与镜台测微尺实际长度的测算 3
表 1 目镜测微尺量测倍率比照表 物镜倍数 目镜倍数 一格单位(μm) 4 10 25.0μm 10 10 10.0μm 20 10 5.0μm 40 10 2.5μm 100 10 1.0μm 【材料、器具与试剂】 （一） 材料： 九里香，扶桑花，少花龙葵，南瓜，凤仙花的新鲜花朵的花粉粒，洋葱鳞茎，口腔上 皮细胞。 （二） 器具： 目镜测微尺，镜台测微尺，光学显微镜，尖头镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，滴管、 吸水纸，牙签，刀片。 （三） 试剂： 蒸馏水，生理盐水，0.1M 碘液。 【实验内容及步骤】 (一)测微尺的操作方法 1.卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上 透镜。 2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使镜台测微尺刻度位于视野中央。 先用低倍物镜观察，调焦至看清镜台测微尺的刻度。 3.小心移动镜台测微尺，同时转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺平行靠近，使两尺 左边的"0"点刻度线对齐，进一步靠近使直线接近重合，然后由左向右找出两尺另一次对齐 重合的直线。 4.记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长 度等于多少μm。（目镜测微尺和镜台测微尺两个重合点的距离越长，则所测得的结果越准 确） 目镜测微尺每格的长度=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数×10μm 图 2 目镜测微尺与镜台测微尺实际长度的测算 3
5计算目镜测微尺每格的长度。例如：测得某显微镜的目镜测微尺50格相当于镜台测 微尺的7格，则目镜测微尺每格长度为：7/50×10μm=14μm格. (二)花粉细胞大小的观察测量 1采集刚开放或将要开放的成熟花朵 2.在载玻片滴12滴蒸馏水： 3.用解剖针将花粉分散于蒸馏水上，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余水分： 4.在显微镜下观察，用目镜测微尺测量10个不同花粉细胞的直径大小的格数，根据校 准的目镜测微尺每隔的实际长度进行换算，计算平均值。 (三)洋葱内表皮细胞大小的观察测量 1切取小块洋葱鳞茎，用尖头镊子撕取其内表皮： 2将内表皮平展在载玻片上，滴1滴蒸馏水： 3盖上盖玻片，压片，用吸水纸吸去多余水分： 4.在显微镜下观察，用目镜测微尺测量10个不同洋葱内表皮细胞的长度和宽度的格数， 根据校准的目镜测微尺每隔的实际长度进行换算，计算平均值。 (四)人口腔上皮细胞大小的观察测量 1取干净载玻片，滴1滴生理盐水 2.用灭菌的牙签的平头端，在口腔颊稍用力轻刮，获取口腔上皮细胞： 3.将牙签取下的细胞释放到载玻片是生理盐水中，为保证效果，可将取样的牙签平头在 溶液中多搅动几次。 4盖上盖玻片，压片，用吸水纸吸去多余水分： 5在显微镜下观察，用目镜测微尺测量10个不同口腔上皮细胞的长度和宽度的格数， 根据校准的目镜测微尺每隔的实际长度进行换算，计算其平均值。 (五)测微尺用完后的处置方法 1细胞大小测定实验结束后，取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒。用擦镜纸擦去目镜测 微尺上的油腻和手印。如用油镜，则可按油镜使用方法处理。 2保持镜台测微尺的干净。注意镜台测微尺刻度是用加拿大树胶和圆形盖波片封合的。 当去除香柏油时，不宜用过多的二甲苯，以免使盖波片下的树胶溶解。 3将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。 【实验报告及思考题】 1.结果记录 ()列表记录目镜测微尺校正结果。 (2)列表记录测量各种细胞大小的结果。 2.思考题 ()当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台 上物体的实际长度是否相同？为什么？ 4
5.计算目镜测微尺每格的长度。例如：测得某显微镜的目镜测微尺 50 格相当于镜台测 微尺的 7 格，则目镜测微尺每格长度为：7/50×10μm =1.4μm /格。 (二)花粉细胞大小的观察测量 1.采集刚开放或将要开放的成熟花朵； 2.在载玻片滴 1~2 滴蒸馏水； 3.用解剖针将花粉分散于蒸馏水上，盖上盖玻片，用吸水纸吸去多余水分； 4.在显微镜下观察，用目镜测微尺测量 10 个不同花粉细胞的直径大小的格数，根据校 准的目镜测微尺每隔的实际长度进行换算，计算平均值。 (三)洋葱内表皮细胞大小的观察测量 1.切取小块洋葱鳞茎，用尖头镊子撕取其内表皮； 2.将内表皮平展在载玻片上，滴 1 滴蒸馏水； 3.盖上盖玻片，压片，用吸水纸吸去多余水分； 4.在显微镜下观察，用目镜测微尺测量 10 个不同洋葱内表皮细胞的长度和宽度的格数， 根据校准的目镜测微尺每隔的实际长度进行换算，计算平均值。 (四)人口腔上皮细胞大小的观察测量 1.取干净载玻片，滴 1 滴生理盐水； 2.用灭菌的牙签的平头端，在口腔颊稍用力轻刮，获取口腔上皮细胞； 3.将牙签取下的细胞释放到载玻片是生理盐水中，为保证效果，可将取样的牙签平头在 溶液中多搅动几次。 4.盖上盖玻片，压片，用吸水纸吸去多余水分； 5.在显微镜下观察，用目镜测微尺测量 10 个不同口腔上皮细胞的长度和宽度的格数， 根据校准的目镜测微尺每隔的实际长度进行换算，计算其平均值。 (五)测微尺用完后的处置方法 1.细胞大小测定实验结束后，取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒。用擦镜纸擦去目镜测 微尺上的油腻和手印。如用油镜，则可按油镜使用方法处理。 2.保持镜台测微尺的干净。注意镜台测微尺刻度是用加拿大树胶和圆形盖波片封合的。 当去除香柏油时，不宜用过多的二甲苯，以免使盖波片下的树胶溶解。 3.将目镜测微尺和镜台测微尺分别用擦镜纸擦拭后，放回盒内保存。 【实验报告及思考题】 1．结果记录 (1) 列表记录目镜测微尺校正结果。 (2) 列表记录测量各种细胞大小的结果。 2．思考题 （1）当接目镜不变，目镜测微尺也不变，只改变接物镜，目镜测微尺每格所量的镜台 上物体的实际长度是否相同？为什么？ 4
实验二细胞膜的渗透性 【实验目的】 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 【实验原理】 细胞膜具有选择透过性，直接调控物质进出细 胞的过程，承担调节细胞渗透平衡和物质跨膜运输 的功能。当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于细 胞膜对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子 不能透入，有的溶质分子可以透入，能透入的溶质 溶血 未容血 分子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，会促使水分进入细胞内，并引 起细胞体积的增大。当红细胞膨胀到一定程度时， 细胞膜破裂，血红素溢出，即红细胞发生溶血。由 于溶质透入细胞内的速度不同，因此溶血时间也不 同。 溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子 量大小有关。相对分子量大的物质进入细胞慢，发 图2细胞溶血前后对比 生溶血所需时间也长：相对分子量小的物质进入细 胞快，发生溶血所需时间短。溶血现象发生的快慢与溶质的脂溶性大小有关。亲脂性化合物 易溶于脂溶剂，在水中一般溶解度很小。一般碳链越长，脂溶性越大。 对于各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。对 于相同摩尔浓度的电解质溶液与非电解质溶液，电解质溶液的产生的渗透压要大很多，例如 当NaCI与乙醇分子数相等时，NaCI产生的渗透压要大得多，是因为NaCI电解为Na和Cr,使 溶质的总摩尔数增加了。 在红细胞溶血实验中，把发生溶血前的溶液浓度近似认定为与红细胞等渗。 【材料、器具与试剂】 (一)材料：小鼠，兔，鸡，鸭等动物的血液。 (二)器具：普通光学显微镜，注射器，刀片，镊子，载玻片，盖玻片，吸管，小烧杯，试 管，试管架，定时秒表，1.5ml离心管，量筒。 (三)试剂：0.17M氯化钠，0.17M氯化铵，0.17M醋酸胺，0.17M硝酸钠，0.12M硫酸 钠：1.0M乙二醇，1.0M丙三醇（甘油），1.0M葡萄糖，1.0M甲醇，10M乙醇，1.0M 丙醇。 【实验步骤】 1,采用适当的方法取实验动物的新鲜血液（兔子用注射器耳静脉取血，小鼠用手术器 械去除眼球采血，鸡、鸭可以宰杀取血)。 5
实验二 细胞膜的渗透性 【实验目的】 了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。 【实验原理】 细胞膜具有选择透过性，直接调控物质进出细 胞的过程，承担调节细胞渗透平衡和物质跨膜运输 的功能。当红细胞置于不同等渗溶液中时，由于细 胞膜对各种溶质的通透性不同，因此有的溶质分子 不能透入，有的溶质分子可以透入，能透入的溶质 分子的速度也不同。当溶质分子进入红细胞使细胞 内溶质浓度增加时，会促使水分进入细胞内，并引 起细胞体积的增大。当红细胞膨胀到一定程度时， 细胞膜破裂，血红素溢出，即红细胞发生溶血。由 于溶质透入细胞内的速度不同，因此溶血时间也不 同。 溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子 量大小有关。相对分子量大的物质进入细胞慢，发 生溶血所需时间也长；相对分子量小的物质进入细 胞快，发生溶血所需时间短。溶血现象发生的快慢与溶质的脂溶性大小有关。亲脂性化合物 易溶于脂溶剂，在水中一般溶解度很小。一般碳链越长，脂溶性越大。 图 2 细胞溶血前后对比 对于各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。对 于相同摩尔浓度的电解质溶液与非电解质溶液，电解质溶液的产生的渗透压要大很多，例如 当NaCl与乙醇分子数相等时，NaCl产生的渗透压要大得多，是因为NaCl电解为Na+ 和Cl- ，使 溶质的总摩尔数增加了。 在红细胞溶血实验中，把发生溶血前的溶液浓度近似认定为与红细胞等渗。 【材料、器具与试剂】 （一）材料：小鼠，兔，鸡，鸭等动物的血液。 （二）器具：普通光学显微镜，注射器，刀片，镊子，载玻片，盖玻片，吸管，小烧杯，试 管，试管架，定时秒表，1.5 ml 离心管，量筒。 （三）试剂：0.17 M 氯化钠，0.17 M 氯化铵，0.17 M 醋酸胺，0.17 M 硝酸钠，0.12 M 硫酸 钠；1.0 M 乙二醇，1.0 M 丙三醇（甘油），1.0 M 葡萄糖，1.0 M 甲醇，1.0 M 乙醇，1.0 M 丙醇。 【实验步骤】 1. 采用适当的方法取实验动物的新鲜血液（兔子用注射器耳静脉取血，小鼠用手术器 械去除眼球采血，鸡、鸭可以宰杀取血）。 5