一、叶绿体的徒手切片观察 1.取新鲜的菠菜叶片，用刀片横向切削一个薄片，置于干净的载玻片上。 2.滴加1滴0.35M氯化钠溶液，加盖玻片，压片，使细胞平展。 3.置普通光学显微镜下观察，可以看到3种类型的细胞：边缘为锯齿形的鳞片状表皮 细胞：构成气孔的成对存在的肾形保卫细胞：排成删栏状的长形和椭圆形的叶肉细胞，内含 叶绿体，呈绿色微榄形。在高倍镜下可看到叶绿体中绿色的基粒。 4.在荧光显微镜下观察，选用B(blue)激发滤片、B双色镜和D(orange)阻断滤片，可观 察到叶绿体发出火红色荧光，气孔发出绿色荧光，保卫细胞的叶绿体呈火红色，围绕气孔排 成一圈。 5.揭下盖玻片，滴加1滴0.01%吖啶橙染液，染色2mi后，加盖玻片，吸去多余溶液， 压片，置荧光显微镜下观察。可观察到叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发绿色荧光。 二、叶绿体的分离提取与观察 1.取新鲜的菠菜叶片，洗净后吸干水分，去除叶梗及粗脉，称取1g样品，置于研钵 中，加入0.35M氯化钠溶液5ml,研磨匀浆。 2.取1.5ml匀浆液于1.5ml离心管中，在离心机中1000pm离心5mim。 3.将离心得到的上清液转入新的1.5ml离心管中，在离心机中3000pm离心5mim 4.弃去上清液，得到沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 5.沉淀用少量0.35M氯化钠溶液悬浮。 6.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片，压片后用普通光学显微镜观察。 7.将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 8.将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，染色2 min,盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 【实验结果与思考题】 】.绘图表示在普通光学显微镜下，徒手切片和分离叶绿体观察的情况 2.记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象。 3.分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 4.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？
一、叶绿体的徒手切片观察 1. 取新鲜的菠菜叶片，用刀片横向切削一个薄片，置于干净的载玻片上。 2. 滴加 1 滴 0.35 M 氯化钠溶液，加盖玻片，压片，使细胞平展。 3. 置普通光学显微镜下观察，可以看到 3 种类型的细胞：边缘为锯齿形的鳞片状表皮 细胞；构成气孔的成对存在的肾形保卫细胞；排成删栏状的长形和椭圆形的叶肉细胞，内含 叶绿体，呈绿色橄榄形。在高倍镜下可看到叶绿体中绿色的基粒。 4. 在荧光显微镜下观察，选用 B(blue)激发滤片、B 双色镜和 O(orange)阻断滤片，可观 察到叶绿体发出火红色荧光，气孔发出绿色荧光，保卫细胞的叶绿体呈火红色，围绕气孔排 成一圈。 5. 揭下盖玻片，滴加 1 滴0.01%吖啶橙染液，染色 2 min后，加盖玻片，吸去多余溶液， 压片，置荧光显微镜下观察。可观察到叶绿体发出桔红色荧光，细胞核则发绿色荧光。 二、叶绿体的分离提取与观察 1. 取新鲜的菠菜叶片，洗净后吸干水分，去除叶梗及粗脉，称取 1 g 样品，置于研钵 中，加入 0.35 M 氯化钠溶液 5 ml，研磨匀浆。 2. 取 1.5 ml 匀浆液于 1.5 ml 离心管中，在离心机中 1000 rpm 离心 5 min。 3. 将离心得到的上清液转入新的 1.5 ml 离心管中，在离心机中 3000 rpm 离心 5 min。 4. 弃去上清液，得到沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。 5. 沉淀用少量 0.35 M 氯化钠溶液悬浮。 6. 取叶绿体悬液 1 滴置于载玻片上，加盖玻片，压片后用普通光学显微镜观察。 7. 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 8. 将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加 1 滴 0.01%吖啶橙荧光染料，染色 2 min，盖上无荧光的盖玻片，用荧光显微镜观察。 【实验结果与思考题】 1. 绘图表示在普通光学显微镜下，徒手切片和分离叶绿体观察的情况。 2. 记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象。 3. 分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？ 4. 普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？ 16
实验七细胞内过氧化物酶的观察 【实验目的】 掌握细胞中过氧化物酶类的鉴定方法 【实验原理】 过氧化物酶类广泛存在于植物体中，主要包括过氧化物酶和过氧化氢酶。过氧化物酶是 活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发有 过程中它的活性不断发生变化，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。细胞中存 在的过氧化物酶能把许多胺类物质氧化成有色化合物，联苯胺可被细胞中的过氧化物酶氧化 成蓝色或者棕色络合物（蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可转变为棕色的联苯胺 踪)，从而显示出细胞内过氧化物酶的分布。过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。 细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢(H,0》,为了解除过氧化氢对细胞的毒害 细胞中的过氧化氢酶将其分解为水和氧气，对机体起保护作用。通过植物块茎与过氧化氢相 遇后发生的反应可间接证实该酶的存在。 过氧化物酶可以催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩 合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物 酶的底物，在过氧化物酶存在下，H,O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4邻甲氧基苯酚， 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其吸光度，即可求出该酶的活性， 【材料、器具与试剂】 (一)材料：马铃薯、洋葱根尖，玉米或水稻根系。 (二)器具：光学显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、刀片、牙签、载玻片、盖玻片、吸水纸、 量筒、烧杯、分光光度计、研钵、秒表、天平。 (三)试剂： 1.0.1%钼酸胺：取0.1g钼酸胺溶于100ml蒸馏水中。 2.1%联苯胺：取1.0g联苯胺溶于100ml蒸馏水中。 3.0.9%生理盐水：取NaC19.0g溶于1000ml蒸馏水中。 4.3%过氧化氢溶液：取过氧化氢溶液3.0m1,加入到97.0ml蒸馏水中。 5.0.1 M Tris-HC1缓冲液(pH8.5):取12.114g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加水稀释，用 HCI调pH至8.5，后定容1L。 6.0.2 M NaH:PO4贮备液：称取27.8 gNaH:PO4·HO,溶于蒸馏水中，定容至1L 7.0.2 M Na.HPO.贮各液：称取53.65 g Na.HPO,·7H,O或71.7 g Na.HPO4·12HO,溶 于蒸馏水中，定容至1L。 8.0.2M磷酸缓冲液(pH6.0):分别取0.2 MNaH.PO4贮备液87.7ml与0.2 M NaHaPO.4 备液12.3ml充分混匀并稀释至200ml。 9.反应混合液：取0.2M磷酸缓冲液(pH6.0)500ml,过氧化氢0.28ml,愈创木酚0.19 ml混合
实验七 细胞内过氧化物酶的观察 【实验目的】 掌握细胞中过氧化物酶类的鉴定方法。 【实验原理】 过氧化物酶类广泛存在于植物体中，主要包括过氧化物酶和过氧化氢酶。过氧化物酶是 活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育 过程中它的活性不断发生变化，一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。细胞中存 在的过氧化物酶能把许多胺类物质氧化成有色化合物，联苯胺可被细胞中的过氧化物酶氧化 成蓝色或者棕色络合物(蓝色物质为中间产物联苯胺蓝，很不稳定，可转变为棕色的联苯胺 腙)，从而显示出细胞内过氧化物酶的分布。过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。 细胞代谢过程会产生对机体有害的过氧化氢(H2O2)，为了解除过氧化氢对细胞的毒害， 细胞中的过氧化氢酶将其分解为水和氧气，对机体起保护作用。通过植物块茎与过氧化氢相 遇后发生的反应可间接证实该酶的存在。 过氧化物酶可以催化过氧化氢氧化酚类的反应，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩 合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。以邻甲氧基苯酚（即愈创木酚）为过氧化物 酶的底物，在过氧化物酶存在下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的4-邻甲氧基苯酚， 红棕色的物质可用分光光度计在470nm处测定其吸光度，即可求出该酶的活性。 【材料、器具与试剂】 （一）材料：马铃薯、洋葱根尖，玉米或水稻根系。 （二）器具：光学显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、刀片、牙签、载玻片、盖玻片、吸水纸、 量筒、烧杯、分光光度计、研钵、秒表、天平。 （三）试剂： 1. 0.1%钼酸胺：取0.1 g钼酸胺溶于100 ml蒸馏水中。 2. 1%联苯胺：取1.0 g联苯胺溶于100 ml蒸馏水中。 3. 0.9%生理盐水：取NaC1 9.0 g溶于1000 ml蒸馏水中。 4. 3%过氧化氢溶液：取过氧化氢溶液3.0 m1，加入到97.0 ml蒸馏水中。 5. 0.1M Tris-HCl缓冲液（pH8.5）：取12.114g三羟甲基氨基甲烷（Tris），加水稀释，用 HCl调pH至8.5，后定容1 L。 6. 0.2 M NaH2PO4贮备液：称取27.8 g NaH2PO4·H2O，溶于蒸馏水中，定容至1 L。 7. 0.2 M Na2HPO4贮备液：称取53.65 g Na2HPO4·7H2O或71.7 g Na2HPO4·12H2O，溶 于蒸馏水中，定容至1 L。 8. 0.2 M磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取0.2 M NaH2PO4贮备液87.7 ml与0.2 M NaH2PO4贮 备液12.3 ml充分混匀并稀释至200 ml。 9. 反应混合液：取0.2 M磷酸缓冲液（pH6.0）500 ml，过氧化氢0.28 ml，愈创木酚0.19 ml混合。 17
【实验步骤】 一、洋葱根尖细胞过氧化物酶(POD)的显示 1.取新鲜洋葱根尖(1~2cm),用刀片纵向切开。 2.将切开的根尖置于载玻片上，滴加1滴0.1%钼酸胺，放置5min。 3.滴加1滴1%联苯胺溶液，用镊子轻搅几下，放置5mi左右，待其出现蓝色 4.用吸水纸吸去多余溶液，用生理盐水冲洗1次。 5.加盖玻片，压片展开，显微镜下观察，可见细胞内部分区域被染成蓝色，即为过氧 化物酶存在的部位 二、马铃薯细胞中过氧化氢酶(CAT)的间接显示 1.将马铃薯洗净，用刀片切成小薄片，置于载玻片上。 2.将3%的过氧化氢溶液滴加在马铃薯薄片上，可见组织四周出现大量的气泡，提示植 物细胞中有过氧化氢酶存在，气泡为过氧化氢水解产生的氧气。 三、过氧化物酶(POD)活性的测定 1.酶液提取：取不同玉米或水稻根系（根系表面水分吸干）1g,剪碎置于研体中，加 5ml0.1MTms-HC1缓冲液(pH85),研磨匀浆。 2.取匀浆液1.5ml,以4000pm离心5min,取出上清液转入新管，保存在冰箱（或冰 浴)备用。 3.取光径1cm比色杯2个，向其中之一加入上述酶液1ml(如醇活性过高可稀释之)， 再加入反应混合液3ml,立即开启秒表记录时间：而向另一比色杯中加入0.2M磷酸缓冲液 (pH6.0),作为零对照。 4.反应时间到达5min时，用分光光度计在470nm波长下测定吸光值。 5.结果计算：以每min吸光度变化（以每ninOD7变化0.01为1个活力单位）表示酶 活性大小（单位：U/g鲜重）。 【实验结果与思考题】 1.简述联苯胺反应显示过氧化物酶的原理。 2.简述间接显示过氧化物氢酶的原理
【实验步骤】 一、洋葱根尖细胞过氧化物酶(POD)的显示 1. 取新鲜洋葱根尖（1~2cm），用刀片纵向切开。 2. 将切开的根尖置于载玻片上，滴加1滴0.1%钼酸胺，放置5 min。 3. 滴加1滴1%联苯胺溶液，用镊子轻搅几下，放置5 min左右，待其出现蓝色。 4. 用吸水纸吸去多余溶液，用生理盐水冲洗1次。 5. 加盖玻片，压片展开，显微镜下观察，可见细胞内部分区域被染成蓝色，即为过氧 化物酶存在的部位。 二、马铃薯细胞中过氧化氢酶（CAT）的间接显示 1. 将马铃薯洗净，用刀片切成小薄片，置于载玻片上。 2. 将3%的过氧化氢溶液滴加在马铃薯薄片上，可见组织四周出现大量的气泡，提示植 物细胞中有过氧化氢酶存在，气泡为过氧化氢水解产生的氧气。 三、过氧化物酶(POD)活性的测定 1. 酶液提取：取不同玉米或水稻根系（根系表面水分吸干）1 g，剪碎置于研钵中，加 5 ml 0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH8.5），研磨匀浆。 2. 取匀浆液1.5 ml，以4 000 rpm离心5 min，取出上清液转入新管，保存在冰箱（或冰 浴）备用。 3. 取光径1cm比色杯2个，向其中之一加入上述酶液1 ml（如酶活性过高可稀释之）， 再加入反应混合液3 ml，立即开启秒表记录时间；而向另一比色杯中加入0.2 M磷酸缓冲液 （pH6.0），作为零对照。 4. 反应时间到达5 min时，用分光光度计在470nm波长下测定吸光值。 5. 结果计算：以每min吸光度变化（以每minOD470nm变化0.01为1个活力单位）表示酶 活性大小（单位：U/g鲜重）。 【实验结果与思考题】 1. 简述联苯胺反应显示过氧化物酶的原理。 2. 简述间接显示过氧化物氢酶的原理。 18
实验八细胞内含物的观察 【实验目的】 1.掌握植物细胞中蛋白质贮藏颗粒的测定方法。 2.掌握细胞碳水化合物的鉴定方法。 3.掌握细胞中脂肪颗粒的鉴定方法。 4.掌握细胞中多糖的鉴定方法， 【实验原理】 细胞中除了含有细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、核糖体等细胞器外，还 含有大量的蛋白质、碳水化合物、脂肪等内含物，对这些内含物进行鉴定和检测，是细胞生 物学的重要研究内容。 蛋白质的鉴定原理：蛋白质是由氨基酸组成的结构复杂的高分子，测试蛋白质常用的方 法是用碘一澳化钾溶液，但浓度较大效果才好。当碘液与细胞中的蛋白质作用时，呈黄色反 应。在显微镜下观察时，可见黄色的颗粒状。注意在进行这种蛋白质鉴定工作之前，先在植 物切片材料上滴加95%的酒精，首先把材料中的脂肪溶解掉，以保证蛋白质颜色反应的正 确性。 淀粉的鉴定原理：糖类是生物机体生命活动能量的主要来源，淀粉是植物细胞内储藏能 量的多糖物质。淀粉在不同植物细胞中形成各种不同形状的颗粒，淀粉有直链和支链之分。 当稀释的碘一碘化钾溶液与淀粉作用时，形成复合物一碘化淀粉，呈特殊的蓝色反应，所以 用碘液测试淀粉是最常用的方法。但需注意如果碘液过浓，会使碘化淀粉变黑，反而不利于 淀粉粒轮纹及脐点的观察。 图8显微镜下的马铃薯淀粉颗粒 脂肪和油滴的鉴定原理：脂肪和油滴也是植物细胞贮藏的主要营养物质之一。脂肪在常 温下为固体形态，油滴则呈液体状态，均不溶于水。常用的显示脂肪的显微化学方法是苏丹 Ⅲ的酒精溶液染色，呈橘红色（但近年已多用苏丹Ⅳ的丙酮染液代替，其染色效果比前者稍
实验八 细胞内含物的观察 【实验目的】 1. 掌握植物细胞中蛋白质贮藏颗粒的测定方法。 2. 掌握细胞碳水化合物的鉴定方法。 3. 掌握细胞中脂肪颗粒的鉴定方法。 4. 掌握细胞中多糖的鉴定方法。 【实验原理】 细胞中除了含有细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、叶绿体、核糖体等细胞器外，还 含有大量的蛋白质、碳水化合物、脂肪等内含物，对这些内含物进行鉴定和检测，是细胞生 物学的重要研究内容。 蛋白质的鉴定原理：蛋白质是由氨基酸组成的结构复杂的高分子，测试蛋白质常用的方 法是用碘一碘化钾溶液，但浓度较大效果才好。当碘液与细胞中的蛋白质作用时，呈黄色反 应。在显微镜下观察时，可见黄色的颗粒状。注意在进行这种蛋白质鉴定工作之前，先在植 物切片材料上滴加 95%的酒精，首先把材料中的脂肪溶解掉，以保证蛋白质颜色反应的正 确性。 淀粉的鉴定原理：糖类是生物机体生命活动能量的主要来源，淀粉是植物细胞内储藏能 量的多糖物质。淀粉在不同植物细胞中形成各种不同形状的颗粒，淀粉有直链和支链之分。 当稀释的碘—碘化钾溶液与淀粉作用时，形成复合物一碘化淀粉，呈特殊的蓝色反应，所以 用碘液测试淀粉是最常用的方法。但需注意如果碘液过浓，会使碘化淀粉变黑，反而不利于 淀粉粒轮纹及脐点的观察。 图 8 显微镜下的马铃薯淀粉颗粒 脂肪和油滴的鉴定原理：脂肪和油滴也是植物细胞贮藏的主要营养物质之一。脂肪在常 温下为固体形态，油滴则呈液体状态，均不溶于水。常用的显示脂肪的显微化学方法是苏丹 Ⅲ的酒精溶液染色，呈橘红色（但近年已多用苏丹Ⅳ的丙酮染液代替，其染色效果比前者稍 19
红和明显)。在鉴定过程中，为了效果明显，可稍加热以促进其反应 细胞内多糖的鉴定是利用过碘酸希夫反应(period acid Schiffreaction),简称PAS反应。 该方法最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖，其基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸 (HO4)氧化后，使多糖释放出醛基，醛基与与Schiff试剂中的无色品红亚硫酸复合物结 合，形成紫红色反应产物，PAS反应阳性部位即表示多糖的存在。因此在有多糖的部位，就 会呈现除紫红色阳性反应。 图9油滴被苏丹Ⅲ染色后的效果 【材料、器具与试剂】 (一）)材料：大豆的种子，马铃薯，花生种子 (二)器具：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、吸水纸、毛笔、刀片、吸水 纸、量筒、烧杯、秒表、天平。 (三)试剂： 1.碘一碘化钾试剂：碘化钾3.0g,加100ml蒸馏水，加热溶解后，加入1.0g碘，再稀 释至300ml,放棕色瓶中保存。 2.苏丹Ⅲ溶液：称取0.1g苏丹Ⅲ，溶解在20m195%酒精中。可用来染木栓、角质层和 脂肪。由于脂肪能溶解在酒精中，因此，用苏丹Ⅲ溶液染脂肪时不能超过10mi。 3.革兰氏碘液：称取1.0g碘化钾，溶于50ml蒸偏水中，再加0.5g碘，使之溶解，最后 用蒸馏水稀释定容至150ml,于棕色瓶中保存。 4.70%乙醇。 5.高碘酸溶液：称取高碘酸(HⅢ04·2H0)0.80g,乙酸钠0.27g,溶于70%乙醇中， 定容至100ml,保存备用。 20
红和明显）。在鉴定过程中，为了效果明显，可稍加热以促进其反应。 细胞内多糖的鉴定是利用过碘酸希夫反应(period acid Schiff reaction)，简称 PAS 反应。 该方法最常用于显示细胞、组织内的多糖和蛋白多糖，其基本原理是：糖被强氧化剂过碘酸 （HIO4）氧化后，使多糖释放出醛基，醛基与与 Schiff 试剂中的无色品红亚硫酸复合物结 合，形成紫红色反应产物，PAS 反应阳性部位即表示多糖的存在。因此在有多糖的部位，就 会呈现除紫红色阳性反应。 图 9 油滴被苏丹 III 染色后的效果 【材料、器具与试剂】 （一）材料：大豆的种子，马铃薯，花生种子 （二）器具：普通光学显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、滴管、吸水纸、毛笔、刀片、吸水 纸、量筒、烧杯、秒表、天平。 （三）试剂： 1. 碘一碘化钾试剂：碘化钾3.0 g，加100 ml蒸馏水，加热溶解后，加入1.0 g碘，再稀 释至300 ml，放棕色瓶中保存。 2. 苏丹III溶液：称取0.1 g苏丹III，溶解在20 m1 95%酒精中。可用来染木栓、角质层和 脂肪。由于脂肪能溶解在酒精中，因此，用苏丹III溶液染脂肪时不能超过10 min。 3. 革兰氏碘液：称取1.0 g碘化钾，溶于50 ml蒸馏水中，再加0.5 g碘，使之溶解，最后 用蒸馏水稀释定容至150 ml，于棕色瓶中保存。 4. 70%乙醇。 5. 高碘酸溶液：称取高碘酸（HIO4·2H2O）0.80 g，乙酸钠0.27 g，溶于70%乙醇中， 定容至100 ml，保存备用。 20