染的病毒等。荧光PCR可以进 步发展为PCR临床自动化诊 断打下基础 2.3.6定量PCR 定量PCR技术是指用外标 法(荧光杂交探针保证特异性) 通过监测PCR过程(监测扩增效 率)达到精确定量起始模板数的 目的,同时以内对照有效排除假 阴性结果(扩增效率为零)。 3DNA测序技术 制作物理图谱的过程是 个逐步精细的过程。第一步把每 条染色体分成平均长度在 400kb的长片段,每段克隆到一 个YAC上,所有YAC克隆都 按照其在染色体上的实际位置 进行排序,我们就得到了一个能 够覆盖整个染色体的YAC文 库 把每一个YAC克隆携带的 染色体片段经部分酶切形成 系列有重叠区域的40kb左右的 片段克隆到粘粒上,得到粘粒文 库。每个粘粒上的染色体片段再 经酶切形成4kb左右的片段克 隆到测序专用的质粒载体上。测 序质粒上携带的4kb的片段就 可以用现在常规测序的方法进 行测序了。把所有质粒克隆的 DNA片段序列读出,再按照各 个片段在染色体上的实际位置 进行排列,最后就可以得到染色 体的全部核苷酸碱基对序列。染 色体的DNA碱基序列是基因组 物理图谱的最精细形式
染的病毒等。荧光 PCR 可以进 一步发展为 PCR 临床自动化诊 断打下基础 2.3.6 定量 PCR 定量 PCR 技术是指用外标 法（荧光杂交探针保证特异性） 通过监测 PCR 过程（监测扩增效 率）达到精确定量起始模板数的 目的，同时以内对照有效排除假 阴性结果(扩增效率为零)。 3 DNA 测序技术 制作物理图谱的过程是一 个逐步精细的过程。第一步把每 条染色体分成平均长度在 400kb 的长片段，每段克隆到一 个 YAC 上，所有 YAC 克隆都 按照其在染色体上的实际位置 进行排序，我们就得到了一个能 够覆盖整个染色体的 YAC 文 库。 把每一个 YAC 克隆携带的 染色体片段经部分酶切形成一 系列有重叠区域的 40kb 左右的 片段克隆到粘粒上，得到粘粒文 库。每个粘粒上的染色体片段再 经酶切形成 4kb 左右的片段克 隆到测序专用的质粒载体上。测 序质粒上携带的 4kb 的片段就 可以用现在常规测序的方法进 行测序了。把所有质粒克隆的 DNA 片段序列读出，再按照各 个片段在染色体上的实际位置 进行排列，最后就可以得到染色 体的全部核苷酸碱基对序列。染 色体的 DNA 碱基序列是基因组 物理图谱的最精细形式
31常规DNA测序技术的 基本原理 所谓"常规测序方法"的基本特 点有两个:第一,把待测序的 DNA分子进行处理,得到每个 只差1个核苷酸的一系列逐步 缩短的DNA分子的混合物;第 二,通过凝胶电泳把这些DNA 分子分离开来,形成阶梯状排列 的条带,然后逐个读出DNA的 碱基序列。 32DNA测序方法 在此介绍四种测序方 3.2.1化学法测序 得到长度只差一个碱基的 DNA分子的方法主要有两种 种是用化学方法把待测序的 DNA片段在每个碱基处切断 次。这是由 Maxam和 Gilbert 发明的方法。具体做法是把待测 序的DNA分子成单链分子,其 5端用32p进行放射性标记。 然后把这些单链DNA分于分成 4份,每份用一种化学试剂处理 DNA片段,每种试剂可使DNA 分子在一种碱基的5端的磷酸 二酯键处发生断裂。例如,试剂 可使单链DNA分子在A碱基 处断裂,试剂二可使单链DNA 分子在T碱基处断裂,依此类 推。把反应条件控制好,使每个 DNA分子只发生一次断裂,这 样,我们就得到4种反应产物 每种由在一种碱基处发生断裂 形成的DNA片段组成。 把这4种反应产物用聚丙 烯凝胶电泳进行分离,两个
3.1 常规 DNA 测序技术的 基本原理 所谓"常规测序方法"的基本特 点有两个：第一，把待测序的 DNA 分子进行处理，得到每个 只差 1 个核苷酸的一系列逐步 缩短的 DNA 分子的混合物；第 二，通过凝胶电泳把这些 DNA 分子分离开来，形成阶梯状排列 的条带，然后逐个读出 DNA 的 碱基序列。 3.2 DNA 测序方法 在此介绍四种测序方法： 3.2.1 化学法测序 得到长度只差一个碱基的 DNA 分子的方法主要有两种。 一种是用化学方法把待测序的 DNA 片段在每个碱基处切断一 次。这是由 Maxam 和 Gilbert 发明的方法。具体做法是把待测 序的 DNA 分子成单链分子，其 5'端用３２p 进行放射性标记。 然后把这些单链 DNA 分于分成 4 份，每份用一种化学试剂处理 DNA 片段，每种试剂可使 DNA 分子在一种碱基的 5'端的磷酸 二酯键处发生断裂。例如，试剂 一可使单链DNA分子在 A碱基 处断裂，试剂二可使单链 DNA 分子在 T 碱基处断裂，依此类 推。把反应条件控制好，使每个 DNA 分子只发生一次断裂，这 样，我们就得到 4 种反应产物， 每种由在一种碱基处发生断裂 形成的 DNA 片段组成。 把这 4 种反应产物用聚丙 烯凝胶电泳进行分离，两个
DNA片段只要相差1个碱基, 就可以在这种凝胶中被分成两 个条带。电泳完成后,用X光 胶片进行曝光,最后得到一张由 不同条带组成的序列图。从这张 图上就可以读出待测DNA片段 的碱基序列。5端的第一个碱 基G读不出来,可以通过测定 互补链的序列测出这个碱基 32.2酸法测序与测序的 自动化 dda ddr ddc 另外一种得到长度只差 个碱基的DNA分子的方法是英 国科学家桑格发明的,这种方法 利用DNA聚合酶以待测序的 DNA单链分子为模版合成互补 的新链。在合成新链时,合成原 料除了4种脱氧核糖核苷酸外 还加入一种2和3位上的羟基 都脱除的核苷酸。由于缺少3 羟基,当这种核苷酸被结合到链 上后,它的后面不能再结合其他 核苷酸,链的合成就此终止。与 化学法测序类似,我们可以准备 4种反应物,加入的核苷酸类似 物分别携带A,G,C,T碱基, 每种反应物里包含在一种碱基 处终止链延伸的长短不同的 DNA片段。这些DNA片段也
DNA 片段只要相差 1 个碱基， 就可以在这种凝胶中被分成两 个条带。电泳完成后，用 X 光 胶片进行曝光，最后得到一张由 不同条带组成的序列图。从这张 图上就可以读出待测 DNA 片段 的碱基序列。 5'端的第一个碱 基 G 读不出来，可以通过测定 互补链的序列测出这个碱基 3.2.2 酸法测序与测序的 自动化 另外一种得到长度只差一 个碱基的 DNA 分子的方法是英 国科学家桑格发明的，这种方法 利用 DNA 聚合酶以待测序的 DNA 单链分子为模版合成互补 的新链。在合成新链时，合成原 料除了 4 种脱氧核糖核苷酸外 还加入一种 2'和 3'位上的羟基 都脱除的核苷酸。由于缺少 3' 羟基，当这种核苷酸被结合到链 上后，它的后面不能再结合其他 核苷酸，链的合成就此终止。与 化学法测序类似，我们可以准备 4 种反应物，加入的核苷酸类似 物分别携带 A，G，C，T 碱基， 每种反应物里包含在一种碱基 处终止链延伸的长短不同的 DNA 片段。这些 DNA 片段也
要用放射性标记,经过凝胶电泳 和放射自显影,得到DNA条带 图谱,根据图谱可以读出DNA 的碱基序列。 这种方法比化学法简单,条 件易于控制。用4种不同的荧光 化合物分别标记4种反应的产 物,就可以做到把4种反应物混 合在一起进行电泳,可以提高电 泳分析的效率。这种方法利用现 代精密仪器和机器人技术可以 实现DNA测序的高度自动化。 目前市场上已经有各种型号的 DNA自动测序仪可供选购 DNA自动测序结果举例 三 部能部 的的 M/NdWArMNYWWYM 323单分子荧光测序 单分子荧光测序是一种快 速DNA测序法,这是利用单分 子操作技术直接读取DNA的碱 基序列的方法,与传统的荧光测 序法相比,这种方法可大大提高 速度。用桑格测序方法现在每天 可以解读上万个碱基序列,但是
要用放射性标记，经过凝胶电泳 和放射自显影，得到 DNA 条带 图谱，根据图谱可以读出 DNA 的碱基序列。 这种方法比化学法简单，条 件易于控制。用 4 种不同的荧光 化合物分别标记 4 种反应的产 物，就可以做到把 4 种反应物混 合在一起进行电泳，可以提高电 泳分析的效率。这种方法利用现 代精密仪器和机器人技术可以 实现 DNA 测序的高度自动化。 目前市场上已经有各种型号的 DNA 自动测序仪可供选购 DNA 自动测序结果举例 3.2.3 单分子荧光测序 单分子荧光测序是一种快 速 DNA 测序法，这是利用单分 子操作技术直接读取 DNA 的碱 基序列的方法，与传统的荧光测 序法相比，这种方法可大大提高 速度。用桑格测序方法现在每天 可以解读上万个碱基序列，但是
如果单分子荧光测序取得成功, 它可以在两分钟内完成传统方 法一天的工作。 单分于荧光测序的主要过 程如下。第一步,取一条大约有 5万个碱基那么长的单链DNA 分子,把它的一端用化学方法连 接在一个非常微小的塑料球上 DNA分子就会缠绕在塑料球 上。第二步,在一张类似激光唱 片的圆盘上铺一层很薄的液体 薄膜,然后用激光光钳把塑料球 放在这张光盘的液体膜上进行 移动,DNA分子就会在后面被 拖着展开,就好像一只船拖着 条绳子快速前进,把绳子拉展 样。第三步,让拉展的的DNA 分子与一种核酸外切酶结合。这 种核酸外切酶可以和DNA的 游离的末端结合,然后逐个把 DNA的碱基切割下来。第四步, 用单分子光谱技术逐个识别并 且读出碱基即达到了测序的目 32.4DNA芯片与杂交测 序 DNA芯片是一种通过杂交 测定未知DNA序列的新技术 在一个玻璃或硅片上合成大量 的寡聚核苷酸片段,例如可以合 成8个碱基长的全部可能的寡 聚核苷酸片段(48=65,536 种)。这些探针一头固定在固体 基质上,另外一端是游离的。它 们在硅片上有规律地排列着,每 个特定位置上探针的序列都是 已知的。 假如有一个DNA片段需要 测序,我们可以把它的单链形式
如果单分子荧光测序取得成功， 它可以在两分钟内完成传统方 法一天的工作。 单分于荧光测序的主要过 程如下。第一步，取一条大约有 5 万个碱基那么长的单链 DNA 分子，把它的一端用化学方法连 接在一个非常微小的塑料球上， DNA 分子就会缠绕在塑料球 上。第二步，在一张类似激光唱 片的圆盘上铺一层很薄的液体 薄膜，然后用激光光钳把塑料球 放在这张光盘的液体膜上进行 移动，DNA 分子就会在后面被 拖着展开，就好像一只船拖着一 条绳子快速前进，把绳子拉展一 样。第三步，让拉展的的 DNA 分子与一种核酸外切酶结合。这 种核酸外切酶可以和 DNA 的 游离的末端结合，然后逐个把 DNA 的碱基切割下来。第四步， 用单分子光谱技术逐个识别并 且读出碱基即达到了测序的目 的。 3.2.4 DNA 芯片与杂交测 序 DNA 芯片是一种通过杂交 测定未知 DNA 序列的新技术。 在一个玻璃或硅片上合成大量 的寡聚核苷酸片段，例如可以合 成 8 个碱基长的全部可能的寡 聚核苷酸片段（ 4８＝65，536 种）。这些探针一头固定在固体 基质上，另外一端是游离的。它 们在硅片上有规律地排列着，每 个特定位置上探针的序列都是 已知的。 假如有一个 DNA 片段需要 测序，我们可以把它的单链形式