段的长度确定。理论上讲,1kb 以内的片段,延伸1分钟足够了 2.2.3PCR最适合条件的 选择 提高PCR的灵敏度及特 异性是PCR能否成功的关键 提高特异性的关键是:① 退火温度应尽可能高;②引物 浓度应尽可能低:③热启动 ( hot start):在第一次DNA变性 后加入1aq酶,以避免第一次 循环前的引物错配所产生的非 特异扩增和引物二联体 2.2.4PCR产物的分析方 法 1、琼脂糖凝胶电泳:判断 扩增片段的存在及大小。 2、点杂交:更适合于扩增 产物为多条带时的测定 3、 Southern杂交:用于鉴 定扩增产物的大小和特异性其 检测敏感度可达10ng 4、酶切分析利用内切酶特 有的酶切点这一特性,达到产物 鉴定目的 5、 PCR-ELISA法:修饰 个引物5端,使其带有便于 PCR产物固定的功能基团,而 通过修饰另一引物5端使其具 有便于酶联显色检测的功能基 团,达到酶联显色
段的长度确定。理论上讲，1kb 以内的片段，延伸 1 分钟足够了 2.2.3 PCR 最适合条件的 选择 提高 PCR 的灵敏度及特 异性是 PCR 能否成功的关键 提高特异性的关键是：① 退火温度应尽可能高；② 引物 浓度应尽可能低；③ 热启动 (hot start)：在第一次 DNA 变性 后加入 Taq 酶，以避免第一次 循环前的引物错配所产生的非 特异扩增和引物二联体 2.2.4 PCR 产物的分析方 法 1、琼脂糖凝胶电泳：判断 扩增片段的存在及大小。 2、点杂交：更适合于扩增 产物为多条带时的测定。 3、Southern 杂交：用于鉴 定扩增产物的大小和特异性其 检测敏感度可达 10ng。 4、酶切分析利用内切酶特 有的酶切点这一特性，达到产物 鉴定目的。 5、PCR-ELISA 法：修饰 一个引物 5’端，使其带有便于 PCR 产物固定的功能基团，而 通过修饰另一引物 5’端使其具 有便于酶联显色检测的功能基 团，达到酶联显色
6、颜色互补分析法:用不 同荧光染料标记不同引物对的 5端,PCR扩增有不同的染料, 因此表现颜色互补而区分出来 7、PCR-HPLC(高压液相 层析)法:PCR产物通过HPLC 仪自动分析,7~8分钟即可显示 并打印结果,HPLC可检出 0.3ng的产物 8、直接检测法:PCR反应 中加入EB,随产物增加,EB 嵌入产物DNA中的量也增加, 从而得出PCR产物的量 2.3几种特殊类型的PCR 在介绍了PCR的基本知识 后,我们来熟悉一下几种特殊类 型的PCR 2.3.1锚定PCR 常采用的PCR必须知道欲 扩增DNA或RNA片段两侧的 序列,而在大多数情况下对某些 序列本身或其旁侧序列并不清 楚,这无疑限制了PCR技术的 广泛应用,“锚定PCR”可以 帮助克服序列未知或序列未全 知带来的障碍 使用一条锚定引物就一条 特异性引物扩增已知一端序列 的目的DNA
6、颜色互补分析法：用不 同荧光染料标记不同引物对的 5’端，PCR 扩增有不同的染料， 因此表现颜色互补而区分出来。 7、PCR-HPLC（高压液相 层析）法：PCR 产物通过 HPLC 仪自动分析，7~8 分钟即可显示 并打印结 果，HPLC 可 检出 0.3ng 的产物。 8、直接检测法：PCR 反应 中加入 EB，随产物增加，EB 嵌入产物 DNA 中的量也增加， 从而得出 PCR 产物的量。 2.3 几种特殊类型的 PCR 在介绍了 PCR 的基本知识 后，我们来熟悉一下几种特殊类 型的 PCR： 2.3.1 锚定 PCR 常采用的 PCR 必须知道欲 扩增 DNA 或 RNA 片段两侧的 序列，而在大多数情况下对某些 序列本身或其旁侧序列并不清 楚，这无疑限制了 PCR 技术的 广泛应用，“锚定 PCR”可以 帮助克服序列未知或序列未全 知带来的障碍 使用一条锚定引物就一条 特异性引物扩增已知一端序列 的目的 DNA
2.3.2不对称 PCR (asymmetric PCR) Gyllensten和 Erlich改进了 PCR方案。在扩增循环中引入 不同引物浓度,由此得到单链 DNA。一般采用50~-100:1比 例的引物浓度,在最初10~15 个循环中主要产物还是双链 DNA,但当低浓度引物被消耗 尽后,高浓度引物介导的PCR 反应就会产生大量单链DNA (single strand dNa, ssdNA (图2-12-5)。分离此扩增产物 中的sDNA可用原引物或第三 条内部引物直接测序。 2.3.3反向PCR( I nverse Inverse-(D)-PCR a DNA with a region of known sed and flanked by restriction sites A within re gions of unknown sequence b. Digestion with enzyme a cleaves the DNA c Ligation of the linear fragments to generate circular DNA molecules 反 d. Digestion with B opens the circular 向 DNA to recreate linear fragments where the unknown sequence is now flanked by portions of the known sequent R 的 e PCR using primers designed from the known sequence generates PRpe用 wo known sequence converged 则 at restriction site A 可 对 个已知的DNA片段两侧的未知 序列进行扩增和研究。选择已知 序列内部没有切点的限制酶对 此段DNA进行酶切,连接形成
2.3.2 不对称 PCR(asymmethic PCR) Gyllensten 和 Erlich 改进了 PCR 方案。在扩增循环中引入 不同引物浓度，由此得到单链 DNA。一般采用 50~100∶1 比 例的引物浓度，在最初 10~15 个循环中主要产物还是双链 DNA，但当低浓度引物被消耗 尽后，高浓度引物介导的 PCR 反应就会产生大量单链 DNA （single strand DNA，ssDNA） （图 2-12-5）。分离此扩增产物 中的 ssDNA 可用原引物或第三 条内部引物直接测序。 2.3.3 反向 PCR (inverse P C R ) 反 向 P C R 的 应 用 则 可 以 对 一 个已知的 DNA 片段两侧的未知 序列进行扩增和研究。选择已知 序列内部没有切点的限制酶对 此段 DNA 进行酶切，连接形成
环状DNA分子,此时选择合适 方向的与已知序列两末端互补 的引物,经PCR后,可以得到 未知序列的DNA片段(),用 此方法建立基因组步移文库,在 分子生物学研究上是非常有意 义的 右图:反向PCR示意图 2.3.4多重 PCR(multiplex PCr 即在同一试管中加入多对 引物,扩增同一模板的几个区 域。如果基因的某一区段缺失 则相应的电泳图谱上这一区带 就会消失。多重PCR反应和 Southern印迹一样可靠,但显 然要简便得多。目前报道的多重 PCR反应,最多可同时扩增12 条区带
环状 DNA 分子，此时选择合适 方向的与已知序列两末端互补 的引物，经 PCR 后，可以得到 未知序列的 DNA 片段（），用 此方法建立基因组步移文库，在 分子生物学研究上是非常有意 义的。 右图：反向 PCR 示意图 2.3.4 多重 PCR(multiplex PCR) 即在同一试管中加入多对 引物，扩增同一模板的几个区 域。如果基因的某一区段缺失， 则相应的电泳图谱上这一区带 就会消失。多重 PCR 反应和 Southern 印迹一样可靠，但显 然要简便得多。目前报道的多重 PCR 反应，最多可同时扩增 12 条区带
Multiplex Pcr Primers are picked from 100 bp from the ends of contig Primo and screened against the entire database vith a stringency of 12/20as a cutoff Primers synthesized on MerMade in 95-vell format (Average concentration is19 pmol/ul) One u l of each primer is pooled for each PCR reaction and the pool is dried and resuspended in 10 ul sdd Ho 9 C for 6 min nce nutes(once) Agarose gel 6 until analysis Cleanup with shrimp alkaline phosphatase "Extract with phenol/chloroform Precipitate vith 2.5 volumes of ethanol acetate and wash vitd n sdh, o in the original volume Tvo ul of the PCR product is thermocycled vith each of the primers individually according to the standard BigDye conditions Primers that generate sequences are removed from the pool and PCR is repeated 2.3.5着色互补 PCR (color comp l ementation assay) 荧光PCR的原理是用不同 的荧光染料,如红色的罗丹明 (6-carboxy-x-rhodamin, POX)I 绿色荧光素 (5-carboxyfluorescein, FAM)S 分别标记于不同的寡核苷酸引 物上,同时扩增多个DNA区段 反应完毕后,利用分子筛除去多 余的引物。用紫外线照射扩增产 物,就能显示某一种或几种荧光 染料颜色的组合,如果某一 DNA区带缺失,则会缺乏相应 的颜色,据此可以很快诊断是否 某种基因缺失,或是发现某些感
2.3.5 着色互补 PCR(color complementation assay) 荧光 PCR 的原理是用不同 的荧光染料，如红色的罗丹明 (6-carboxy-x-rhodamin, POX)和 绿色荧光素 (5’-carboxyfluorescein，FAM)等 分别标记于不同的寡核苷酸引 物上，同时扩增多个 DNA 区段， 反应完毕后，利用分子筛除去多 余的引物。用紫外线照射扩增产 物，就能显示某一种或几种荧光 染料颜色的组合，如果某一 DNA 区带缺失，则会缺乏相应 的颜色，据此可以很快诊断是否 某种基因缺失，或是发现某些感