的特点,故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指 标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时,选用与供试品分子结 构与性质相同或相似的对照品十分重要。 按各品种项下规定的方法,除另有规定外,同样采用分子量对照品和适宜 的GPC软件,以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准 曲线的线性回归方程lgMw-atbR,供试品采用适宜的GPC软件处理结果,并按下 列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。 Mn=∑RIi/∑(RIi/Mn) Mw=∑(RiMi)/∑RL D=MwMn。 式中Mn为数均分子量: Mw为重均分子量 D为分布系数 RLi为供试品在保留时间i时的峰高; 舰为供试品在保留时间i时的分子量 (3)高分子杂质测定法 高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质,通常是药物在 生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏 反应的高分子按各品种项下规定的色谱条件进行分离。 定量方法 ①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。 般用于高分子杂质含量较低的品种。 ②面积归一化法同高效液相色谱法项下规定 ③限量法除另有规定外,规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组 分,一般用于混合物中高分子物 ④自身对照外标法一般用于 Sephadex G-IO凝胶色谱系统中β内酰胺抗生素中 高分子杂质的检査。在该分离系统中,除部分寡聚物外,β内酰胺抗生素中高 分子杂质在色谱过程中均不保留,即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰 以供试品自身为对照品,按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。 【附注】 Sephadex G1O的处理方法 色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶 Sepha-dexG-lO用水浸泡48小时, 使 之充分溶胀,搅拌除去空气泡,徐徐倾人玻璃柱,一次性装填完毕,以免分 层,然后用水将附着玻璃管壁的 Sephadex G-lO洗下,使色谱柱面平整,新填装的 色谱柱要先用水连续冲洗4~6小时,以排出柱中的气泡。 供试品的加入进样可以采用自动进样阀,也可以直接将供试品加在床的表 面(此时,先将床表面的流动相吸干或渗干,立即将供试品溶液沿着色谱管壁 转圈缓缓加入,注意勿使填充剂翻起,待之随着重力的作用渗入固定相后,再 沿着色谱管壁转圈缓缓加入3~5m流动相,以洗下残留在色谱管壁的供试品溶 页码数:2005版药典附录第56页
的特点，故生物大分子聚合物分子量与分子量分布是控制该类产品的关键指 标。在测定生物大分子聚合物分子量与分子量分布时，选用与供试品分子结 构与性质相同或相似的对照品十分重要。 按各品种项下规定的方法，除另有规定外，同样采用分子量对照品和适宜 的 GPC 软件，以对照品重均分子量(Mw)的对数值对相应的保留时间(tR)制得标准 曲线的线性回归方程 lgMw—a+btR，供试品采用适宜的 GPC 软件处理结果，并按下 列公式计算出供试品的分子量与分子量分布。 Mn=∑RIi／∑(RIi／Mi) Mw=∑(RIiMi)／∑RL D=Mw/Mn。 式中 Mn 为数均分子量； Mw 为重均分子量； D 为分布系数； RLi 为供试品在保留时间 i 时的峰高； 舰为供试品在保留时间 i 时的分子量。 (3)高分子杂质测定法 高分子杂质系指供试品中含有分子量大于药物分子的杂质，通常是药物在 生产或贮存过程中产生的高分子聚合物或在生产过程中未除尽的可能产生过敏 反应的高分子按各品种项下规定的色谱条件进行分离。 定量方法 ①主成分自身对照法同高效液相色谱法项下规定。 一般用于高分子杂质含量较低的品种。 ②面积归一化法 同高效液相色谱法项下规定。 ③限量法除另有规定外，规定不得检出保留时间小于对照品保留时间的组 分，一般用于混合物中高分子物 ④自身对照外标法一般用于Sephadex G-lO 凝胶色谱系统中β内酰胺抗生素中 高分子杂质的检查。在该分离系统中，除部分寡聚物外，β内酰胺抗生素中高 分子杂质在色谱过程中均不保留，即所有的高分子杂质表现为单一的色谱峰， 以供试品自身为对照品，按外标法计算供试品中高分子杂质的相对百分含量。 【附注】 Sephadex G-IO 的处理方法 色谱柱的填装装柱前先将约15g葡聚糖凝胶Sepha—dex G-lO用水浸泡48小时， 使 之充分溶胀，搅拌除去空气泡，徐徐倾人玻璃柱，一次性装填完毕，以免分 层，然后用水将附着玻璃管壁的 Sephadex G-lO 洗下，使色谱柱面平整，新填装的 色谱柱要先用水连续冲洗 4～6 小时，以排出柱中的气泡。 供试品的加入进样可以采用自动进样阀，也可以直接将供试品加在床的表 面(此时，先将床表面的流动相吸干或渗干，立即将供试品溶液沿着色谱管壁 转圈缓缓加入，注意勿使填充剂翻起，待之随着重力的作用渗入固定相后，再 沿着色谱管壁转圈缓缓加入 3～5ml 流动相，以洗下残留在色谱管壁的供试品溶 液)。 页码数： 2005 版药典附录第 56 页
附录XC干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑 本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(wSH)受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的 作用,用结晶紫对存活的wISH细胞染色,于波长570nm处测定其吸光可得到干 扰素对WISH细胞的保护效应曲线,以此测干扰素生物学活性。 试剂(1)MEM或RPMI640培养液取MEM或RPMI1640培养基粉末1袋(规 格为1), 加水溶解并稀释至100m,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g, 溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存 (2)完全培养液量取新生牛血清10ml,加MEM或RPMI1640培养液90ml4℃ 保存 (3)测定培养液量取新生牛血清7ml,加MEM或RPM1640培养液93ml。4℃ 保存 (4)攻毒培养液量取新生牛血清3m,加MEM或RPM1640培养液97ml。4℃ 保存 (5)消化液取乙二胺四乙酸二钠O.2g、氯化钠8.Og、氯化钾0.2g、磷酸 氢 二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g,加水溶解并稀释至1000ml,经12l℃15分钟灭菌。 (6)染色液取结晶紫50mg,加无水乙醇20m溶解后,加水稀释至10ml,即得 (7)脱色液取无水乙醇50ml、乙酸O.1ml,加水稀释至100ml (8)PBS取氯化钠8.Og、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾O.24g, 加水溶解并稀释至100mnl,经12l℃(215分钟灭菌 标准品溶液的制备取人干扰素生物学活性测定的国家标准品,按说明书复 溶后,用测定培养液稀释至每lml含1000U。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀 释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作 供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后,用测定培养液稀释成每lm约含 l000IU。在%6孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个 孔。在无菌条件下操作。 测定法使wISH细胞在培养基中贴壁生长。按1:2~1:4传代,每周2~3 次 于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液,用PBS洗2次后消化和收集细 胞,用完全培养液配制成每lml含2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液,接种于 96孔细胞培养板中,每孔100u。于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时。将配 制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加入 100μ1。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时。弃去细胞培养板中的上清 液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV,一70℃保存)用攻毒培养液稀释至100CID50, 每孔100μ1。于37℃、5%二氧化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50%病变点在 lU/m1)。然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔加入染色液50μl,室温放置30 分钟后,用流水小心冲去染色液,并吸干残留水分,每孔加入脱色液100u,室 温放置3~5分钟。混匀后,用酶标仪以630nm为参比波长,在波长570nm处测定吸 光度,记录测定结果 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试 验结果 供试品生物学活性(IU/m1)= PrXds'* Es/Dr*er
附录 X C 干扰素生物学活性测定法(细胞病变抑 制法) 本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的 作用，用结晶紫对存活的 WISH 细胞染色，于波长 570nm 处测定其吸光可得到干 扰素对 WISH 细胞的保护效应曲线，以此测干扰素生物学活性。 试剂 (1)MEM 或 RPMI 1640 培养液取 MEM 或 RPMI 1640 培养基粉末 1 袋(规 格为 1L)， 加水溶解并稀释至 1000ml，加青霉素 10 5 IU 和链霉素 10 5 IU，再加碳酸氢钠 2．1g， 溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。 (2)完全培养液 量取新生牛血清 10ml，加 MEM 或 RPMI 1640 培养液 90ml。4℃ 保存。 (3)测定培养液量取新生牛血清 7ml，加 MEM 或 RPMI 1640 培养液 93ml。4℃ 保存。 (4)攻毒培养液量取新生牛血清 3ml，加 MEM 或 RPMI 1640 培养液 97ml。4℃ 保存。 (5)消化液 取乙二胺四乙酸二钠 O．2g、氯化钠 8．Og、氯化钾 0．2g、磷酸 氢 二钠 1．152g、磷酸二氢钾 0．2g，加水溶解并稀释至 1000ml，经 121℃ 15 分钟灭菌。 (6)染色液取结晶紫 50mg，加无水乙醇 20ml 溶解后，加水稀释至 100ml，即得。 (7)脱色液取无水乙醇 50ml、乙酸 O．1ml，加水稀释至 100ml。 (8)PBS 取氯化钠 8．Og、氯化钾 0．20g、磷酸氢二钠 1．44g、磷酸二氢钾 O．24g， 加水溶解并稀释至 1000ml，经 121℃(2 15 分钟灭菌。 标准品溶液的制备 取人干扰素生物学活性测定的国家标准品，按说明书复 溶后，用测定培养液稀释至每 lml 含 1000IU。在 96 孔细胞培养板中，做 4 倍系列稀 释，共 8 个稀释度，每个稀释度做 2 孔。在无菌条件下操作。 供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后，用测定培养液稀释成每 lml 约含 1000IU。在 96 孔细胞培养板中，做 4 倍系列稀释，共 8 个稀释度，每个稀释度做 2 个 孔。在无菌条件下操作。 测定法 使 WISH 细胞在培养基中贴壁生长。按 1：2～1：4 传代，每周 2～3 次， 于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液，用 PBS 洗 2 次后消化和收集细 胞，用完全培养液配制成每 lml 含 2．5×10 5～3．5×10 5 个细胞的细胞悬液，接种于 96 孔细胞培养板中，每孔 100ul。于 37℃、5％二氧化碳条件下培养 4～6 小时。将配 制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种 WISH 细胞的培养板中，每孔加入 100μ1。于 37℃、5％二氧化碳条件下培养 18～24 小时。弃去细胞培养板中的上清 液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV，一 70℃保存)用攻毒培养液稀释至 100CCID50， 每孔 100μ1。于 37℃、5％二氧化碳培养 24 小时(镜检标准品溶液的 50％病变点在 1IU／m1)。然后弃去细胞培养板中的上清液，每孔加入染色液 50μ1，室温放置 30 分钟后，用流水小心冲去染色液，并吸干残留水分，每孔加入脱色液 100ul，室 温放置 3～5 分钟。混匀后，用酶标仪以 630nm 为参比波长，在波长 570nm 处测定吸 光度，记录测定结果。 试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试 验结果 供试品生物学活性(IU／m1)=Pr×Ds*Es/Dr*Er
式中Pr为标准品生物学活性,lU/ml Ds为供试品预稀释倍数; Dr为标准品预稀释倍数 Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数 Er为标准品半效稀释倍数。 页码数:2005版药典附录第41页 附录ⅧL干燥失重测定 取供试品,混合均匀(如为较大的结晶,应先迅速捣碎使成2mm以下的小粒), 取约1g或各品种项下规定的重量,置与供试品相同条件下干燥至恒重的扁形称 量瓶中,精密称定,除另有规定外,在105℃干燥至恒重。由减失的重量和取样 量计算供试品的干燥失重。 供试品干燥时,应平铺在扁形称量瓶中,厚度不可超过5mm,如为疏松物 质,厚度不可超过l0mm。放入烘箱或干燥器进行干燥时,应将瓶盖取下,置称 量瓶旁,或将瓶盖半开进行干燥:取出时,须将称量瓶盖好。置烘箱内干燥的 供试品,应在干燥后取出置干燥器中放冷,然后称定重量 供试品如未达规定的干燥温度即融化时,应先将供试品于较低的温度下干 燥至大部分水分除去后,再按规定条件干燥。 当用减压干燥器或恒温减压干燥器时,除另有规定外,压力应在2.67kPa (20mmHg)以下;干燥器中常用的干燥剂为无水氯化钙、硅胶或五氧化二磷;恒 温减压干燥器中常用的干燥剂为五氧化二磷,除另有规定外,温度为60℃。干 燥剂应保持在有效状态。 页码数:2005版药典附录第54页 附录ⅨP肝素含量测定法(凝固法 本法系依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素,从而影响血浆凝固时间的原 理,测定供试品中肝素含量。 试剂(1)缺血小板人血浆无菌采集人全血于3.8%枸橼酸钠抗凝剂(9:1)中, 混匀,以每分钟1500转在4℃离心30分钟,用塑料注射器取上层2/3的血浆,以每 分钟3500转在4℃离心30分钟,取上层2/3血浆,分装于塑料管中,每支3m,保 存-40℃备用。 (2)三羟甲基氨基甲烷(Iris缓冲液(pH7.5)取三羟甲基氨基甲烷7.27g、氯化钠 27g,加水溶解并稀释至100mn(用盐酸调节pH至7.5) (3)脑磷脂混悬液冻干脑磷脂加水复溶,取适量,用生理氯化钠溶液稀释,稀 释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在200~300秒, (4)O.025mol/L氯化钙溶液取氯化钙(caCl2·2H20)147g溶于1000ml水 中,制成 lmol/L氯化钙贮备液。临用时,用水将lmol/L氯化钙贮备液稀释40倍 (5)硫酸鱼精蛋白溶液取硫酸鱼精蛋白适量,用pH7.5Tris缓冲液溶解并稀释
式中 Pr 为标准品生物学活性，1U／ml； Ds 为供试品预稀释倍数； Dr 为标准品预稀释倍数； Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数； Er 为标准品半效稀释倍数。 页码数： 2005 版药典附录第 41 页 附录ⅦL 干燥失重测定 法 取供试品，混合均匀(如为较大的结晶，应先迅速捣碎使成 2mm 以下的小粒)， 取约 1g 或各品种项下规定的重量，置与供试品相同条件下干燥至恒重的扁形称 量瓶中，精密称定，除另有规定外，在 105℃干燥至恒重。由减失的重量和取样 量计算供试品的干燥失重。 供试品干燥时，应平铺在扁形称量瓶中，厚度不可超过 5mm，如为疏松物 质，厚度不可超过 10mm。放入烘箱或干燥器进行干燥时，应将瓶盖取下，置称 量瓶旁，或将瓶盖半开进行干燥；取出时，须将称量瓶盖好。置烘箱内干燥的 供试品，应在干燥后取出置干燥器中放冷，然后称定重量。 供试品如未达规定的干燥温度即融化时，应先将供试品于较低的温度下干 燥至大部分水分除去后，再按规定条件干燥。 当用减压干燥器或恒温减压干燥器时，除另有规定外，压力应在 2．67kPa (20mmHg)以下；干燥器中常用的干燥剂为无水氯化钙、硅胶或五氧化二磷；恒 温减压干燥器中常用的干燥剂为五氧化二磷，除另有规定外，温度为 60℃。干 燥剂应保持在有效状态。 页码数： 2005 版药典附录第 54 页 附录ⅨP 肝素含量测定法 (凝固法) 本法系依据硫酸鱼精蛋白能中和抗凝剂肝素，从而影响血浆凝固时间的原 理，测定供试品中肝素含量。 试剂(1)缺血小板人血浆 无菌采集人全血于 3．8％枸橼酸钠抗凝剂(9：1)中， 混匀，以每分钟 1500 转在 4℃离心 30 分钟，用塑料注射器取上层 2／3 的血浆，以每 分钟 3500 转在 4℃离心 30 分钟，取上层 2／3 血浆，分装于塑料管中，每支 3ml，保 存-40℃备用。 (2)三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液(pH7．5)取三羟甲基氨基甲烷 7．27g、氯化钠 5．27g，加水溶解并稀释至 1000ml(用盐酸调节 pH 至 7．5)。 (3)脑磷脂混悬液冻干脑磷脂加水复溶，取适量，用生理氯化钠溶液稀释，稀 释后的脑磷脂混悬液应使空白凝固时间在 200～300 秒。 (4)O．025 mol／L 氯化钙溶液 取氯化钙(CaCl2·2H2 0)147g 溶于 1000ml 水 中，制成 1mol／L 氯化钙贮备液。临用时，用水将 1mol／L 氯化钙贮备液稀释 40 倍。 (5)硫酸鱼精蛋白溶液取硫酸鱼精蛋白适量，用 pH7．5 Tris 缓冲液溶解并稀释
成每lml含1~20mg的溶液。 供试品溶液的制备于每支含不冋浓度的硫酸鱼精蛋白溶液10μl的塑料管中, 分别加入按标示量复溶后的供试品0.5ml,混匀 测定法在已含有缺血小板人血浆0.1ml的塑料管中,加人脑磷脂混悬液 O.lml,混匀,37℃放置1分钟,加供试品溶液0.1ml、已预热至37℃的 0.025mol/L氯化钙溶液0.lml,记录凝固时间。用Tris缓冲液(pH7.5).lml替 代供试品溶液,同法操作作空白对照。空白对照凝固时间不低于200秒试验成 立。取凝固时间最短的供试品管,作为硫酸鱼精蛋白中和0.5m供试品中的肝素 量。硫酸鱼精蛋白10μg中和lU肝素。例如凝固时间最短的供试品管中含硫酸鱼 精蛋白30ug,则中和供试品O.5m中的肝素量则为3,即供试品每lml含6U肝 素 【附注】直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品 页码数:2005版药典附录第17页 附录ⅢB高效液相 色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人裝有填充剂的色谱 柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品,由流动相带入柱内,各成分在 柱内被分离,并依次进入检测器,由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色 谱信号。 1.对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符 合有关规定 (1)色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性 填充剂,以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用,辛基硅烷键合硅胶和其他类型的 硅烷键合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。正相色谱系 统使用极性填充剂,常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色 谱:凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等:手性键合填充剂用 于对映异构体的拆分分析 填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖 度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充,直接影响待测物的保留行为和 分离效果。孔径在15nm(lnm-10A)以下的填料适合于分析分子量小于2000的化合 物,分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用pH28的流动相。当pH大于8 可使载体硅胶溶解;当p小于2时,与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色 谱系统中需使用pH大于8的流动相时,应选用耐碱的填充剂,如采用高纯硅胶 为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化 填充剂或非硅胶填充剂等;当需使用pH小于2的流动相时,应选用耐酸的填充 剂,如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十 八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等 (2)检测器最常用的检测器为紫外检测器,其他常见的检测器有二极管阵列检 测器①DAD)、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器
成每 lml 含 1～20 mg 的溶液。 供试品溶液的制备于每支含不同浓度的硫酸鱼精蛋白溶液 10μl 的塑料管中， 分别加入按标示量复溶后的供试品 0．5ml，混匀。 测定法在已含有缺血小板人血浆 0．1ml 的塑料管中，加人脑磷脂混悬液 O．1ml，混匀，37℃放置 1 分钟，加供试品溶液 0．1ml、已预热至 37℃的 0．025 mol／L 氯化钙溶液 0．1ml，记录凝固时间。用 Tris 缓冲液(pH7．5)O．1ml 替 代供试品溶液，同法操作作空白对照。空白对照凝固时间不低于 200 秒试验成 立。取凝固时间最短的供试品管，作为硫酸鱼精蛋白中和 0．5ml 供试品中的肝素 量。硫酸鱼精蛋白 10μg 中和 1IU 肝素。例如凝固时间最短的供试品管中含硫酸鱼 精蛋白 30μg，则中和供试品 O．5ml 中的肝素量则为 3IU，即供试品每 lml 含 6IU 肝 素。 【附注】直接与血和血浆接触的器具应为塑料制品或硅化的玻璃制品。 页码数： 2005 版药典附录第 17 页 附录ⅢB 高效液相 色谱法 高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵人装有填充剂的色谱 柱进行分离测定的色谱方法。注入的供试品，由流动相带入柱内，各成分在 柱内被分离，并依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色 谱信号。 1．对仪器的一般要求 所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符 合有关规定。 (1)色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。反相色谱系统使用非极性 填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的 硅烷键合硅胶(如氰基硅烷键合相和氨基硅烷键合相等)也有使用。正相色谱系 统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。离子交换填充剂用于离子交换色 谱；凝胶或高分子多孔微球等填充剂用于分子排阻色谱等；手性键合填充剂用 于对映异构体的拆分分析。 填充剂的性能(如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖 度、含碳量和键合类型等)以及色谱柱的填充，直接影响待测物的保留行为和 分离效果。孔径在 15nm(1nm 一 10A)以下的填料适合于分析分子量小于 2000 的化合 物，分子量大于 2000 的化合物则应选择孔径在 30nm 以上的填料。 以硅胶为载体的一般键合固定相填充剂适用 pH2~8 的流动相。当 pH 大于 8 时， 可使载体硅胶溶解；当 pH 小于 2 时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色 谱系统中需使用 pH 大于 8 的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶 为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化 填充剂或非硅胶填充剂等；当需使用 pH 小于 2 的流动相时，应选用耐酸的填充 剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护作用的二异丙基或二异丁基取代十 八烷基硅烷键合硅胶、有机-无机杂化填充剂等。 (2)检测器最常用的检测器为紫外检测器，其他常见的检测器有二极管阵列检 测器(DAD)、荧光检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、电化学检测器
和质谱检测器等 紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器,其响应值不仅 与待测溶液的浓度有关,还与化合物的结构有关:示差折光检测器和蒸发光散 射检测器为通用型检测器,对所有的化合物均有响应;蒸发光散射检测器对结 构类似的化合物,其响应值几乎仅与待测物的质量有关:二极管阵列检测器可 以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱,故可用于待测物的光谱鉴定 和色谱峰的纯度检查 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待附录ⅢB高效液相色谱 法测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系,但蒸发光散射检测器响应值与待测 溶液的浓度通常并不呈线性关系,必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。 不同的检测器,对流动相的要求不同。如采用紫外检测器,所用流动相应至 少符合紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)项下对溶剂的要求:采用低波长检测 时,还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长,并选用色谱级有机溶剂。蒸 发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。 (3)流动相由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态,故对于十八烷基硅烷 键合硅胶为固定相的反相色谱系统,流动相中有机溶剂的比例通常应不低于 5%,否则Cl8链的随机卷曲将导致组分保留值变化,造成色谱系统不稳定。 各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变 外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流 动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变,以适 应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种,必须用特定 牌号的填充剂方能满足分离要求者,可在该品种项下注明。 2.系统适用性试验 色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等 个指标。其中,分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验,即用规定的对照品对色谱系 统进行试验,应符合要求。如达不到要求,可对色谱分离条件作适当的调整 (1)色谱柱的理论板数(n)在规定的色谱条件下,注入供试品溶液或各品种项下 规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留 时间tR以分钟或长度计,下同,但应取相同单位)和半高峰宽(Wh/z),按 n=5.54(tR/Wh/2)2计算色谱柱的理论板数。 (2)分离度(R)无论是定性鉴别还是定量分析,均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为: R=2(tR2tRI/wl+w2 式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间 tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间; w及W2为此相邻两峰的峰宽(如图,图略) 除另有规定外,定量分析时分离度应大于1·5 (3)重复性取各品种项下的对照溶液,连续进样5次,除另有规定外,其峰面 积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下 配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液,加入规定量的内标溶液,配成3 种不同浓度的溶液,分别至少进样2次,计算平均校正因子。其相对标准偏差 应不大于2·0% (4)拖尾因子(T)为保证分离效果和测量精度,应检查待测峰的拖尾因子是否
和质谱检测器等。 紫外、二极管阵列、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅 与待测溶液的浓度有关，还与化合物的结构有关；示差折光检测器和蒸发光散 射检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结 构类似的化合物，其响应值几乎仅与待测物的质量有关；二极管阵列检测器可 以同时记录待测物在规定波长范围内的吸收光谱，故可用于待测物的光谱鉴定 和色谱峰的纯度检查。 紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与待附录ⅢB 高效液相色谱 法测溶液的浓度在一定范围内呈线性关系，但蒸发光散射检测器响应值与待测 溶液的浓度通常并不呈线性关系，必要时需对响应值进行数学转换后进行计算。 不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应至 少符合紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)项下对溶剂的要求；采用低波长检测 时，还应考虑有机相中有机溶剂的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸 发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不挥发盐组分的流动相。 (3)流动相 由于 C18 链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于十八烷基硅烷 键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于 5％，否则 C18 链的随机卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不稳定。 各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变 外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流 动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适 应具体的色谱系统并达到系统适用性试验的要求。但对某些品种，必须用特定 牌号的填充剂方能满足分离要求者，可在该品种项下注明。 2．系统适用性试验 色谱系统的适用性试验通常包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四 个指标。其中，分离度和重复性是系统适用性试验中更具实用意义的参数。 按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品对色谱系 统进行试验，应符合要求。如达不到要求，可对色谱分离条件作适当的调整。 (1)色谱柱的理论板数(n)在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下 规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留 时间 tR 以分钟或长度计，下同，但应取相同单位)和半高峰宽(Wh／z)，按 n=5．54(tR／Wh／2)2 计算色谱柱的理论板数。 (2)分离度(R) 无论是定性鉴别还是定量分析，均要求待测峰与其他峰、内标 峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。分离度的计算公式为： R=2(tR2tRl)/w1+w2 式中 tR2 为相邻两峰中后一峰的保留时间； tR1 为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1 及 W2 为此相邻两峰的峰宽(如图,图略） 除另有规定外，定量分析时分离度应大于 1·5。 (3)重复性取各品种项下的对照溶液，连续进样 5 次，除另有规定外，其峰面 积测量值的相对标准偏差应不大于 2．0％。也可按各品种校正因子测定项下， 配制相当于 80％、100％和 120％的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成 3 种不同浓度的溶液，分别至少进样 2 次，计算平均校正因子。其相对标准偏差 应不大于 2·0％。 (4)拖尾因子(T) 为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否