n为供试品的稀释倍数 VI为供试品总氮测定溶液的体积,ml: V2为供试品非氮测定溶液的体积,ml 14.01为氮的相对原子质量 6.25为常数(1g氮相当于6.25g蛋白质) 附注】(1)供试品蛋白质含量如超过10%(g/m1),除蛋白质时应适当加大供 试品稀释倍数,10%钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例増加,使溶液中 的钨酸浓度仍保持1%。 (2)总氮测定和非蛋白氮测定可用同一空白对照。 第二法 Lowry法 本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜一蛋白质 复合物,此复合物加入酚试剂后,产生蓝色化合物,该蓝色化合物在650nm处 的吸光度与蛋白质含量成正比,根据供试品的吸光度,计算供试品的蛋白质 含量 试剂(1)酚试剂取钨酸钠NazW04·2HzO)l00g、钼酸钠(NazM04·2H20)25g 置1500m 蒸馏瓶中,加入π00ml水、85%磷酸5σml、盐酸100ml,上连回流管(使用木塞或锡纸 包裹的橡皮塞)微沸回流10小时。取下回流管,加入硫酸锂150g、水50m、溴液几 滴,煮沸约15分钟,驱除过量的溴。冷却,加水至1000m,过滤,为酚试剂贮备 液 酚试剂贮备液用氢氧化钠滴定液(O.5mol/L)测定酸浓度,然后加水稀释至 相当于1mol/L盐酸浓度 (2)碱性铜溶液取0.lmol/L酒石酸钾溶液与O.04mo/L硫酸铜溶液各 0.5ml, 4%碳酸钠溶液与O.8%氢氧化钠溶液各25ml,摇匀,即得。本液应临用配制。 (3)氢氧化钠滴定液(O.5mol/L)的配制及标定取氢氧化钠适量,加水搅拌使 溶解成饱和溶液,冷却后,置聚乙烯塑料瓶中,静止数日,澄清后,取澄淸的 氢氧化钠饱和溶液28ml,加新煮沸后冷却的水,使成1000ml,摇匀。 取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g,精密称定,加新沸过的冷 水50ml,振摇,使其尽量溶解:;加酚酞指示剂2滴,用本液滴定:在接近终点 时,应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解,滴定至溶液显粉红色。每lml氢氧化钠滴定 液相当于102.mg的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的 取用量,算出本液的浓度 标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支,用水定量稀释至每lm含 mg,作为贮备液。精密量取贮备液2.5m置25m量瓶中,用水稀释至刻度,摇 匀,即为每lm含100μg的标准蛋白质溶液。 测定法精密量取一定体积供试品(含蛋白质50μg左右)置试管内,加水至lml 加碱性铜溶液5ml,摇匀,室温放置10分钟,快速加入酚试剂O.5m,摇匀,室 温放置30分钟,显色后,照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA),在波长650nm处测 定吸光度(呈色后,如发现浑浊,经每分钟3000转离心15分钟后,取上清液测定) 精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、O.4ml、O.6m、0.8ml、1.0m1分别置于试管 中,自"加水至Iml"0,同法操作。准确量取水lml,自“加碱性铜溶液5m”起,同法 操作,作空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度,求直线回归方 程:将测得供试品的吸光度代入直线回归方程,即得供试品的蛋白质含量
n 为供试品的稀释倍数； V1 为供试品总氮测定溶液的体积，ml； V2 为供试品非氮测定溶液的体积，ml； 14．01 为氮的相对原子质量； 6．25 为常数(1g 氮相当于 6．25g 蛋白质)。 【附注】 (1)供试品蛋白质含量如超过 10％(g／m1)，除蛋白质时应适当加大供 试品稀释倍数，10％钨酸钠溶液及硫酸溶液用量相应地按比例增加，使溶液中 的钨酸浓度仍保持 1％。 (2)总氮测定和非蛋白氮测定可用同一空白对照。 第二法 Lowry 法 本法用于微量蛋白质的含量测定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜一蛋白质 复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在 650nm 处 的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质 含量。 试剂(1)酚试剂 取钨酸钠(NazW04·2HzO)100g、钼酸钠(NazM004·2H20)25g， 置 1500ml 蒸馏瓶中，加入 700ml 水、85％磷酸 50ml、盐酸 100ml，上连回流管(使用木塞或锡纸 包裹的橡皮塞)微沸回流 10 小时。取下回流管，加入硫酸锂 150g、水 50ml、溴液几 滴，煮沸约 15 分钟，驱除过量的溴。冷却，加水至 1000ml，过滤，为酚试剂贮备 液。 酚试剂贮备液用氢氧化钠滴定液(O．5mol／L)测定酸浓度，然后加水稀释至 相当于 1mol／L 盐酸浓度。 (2)碱性铜溶液 取 0．1mol／L 酒石酸钾溶液与 O．04mol／L 硫酸铜溶液各 0．5 ml， 4％碳酸钠溶液与 O．8％氢氧化钠溶液各 25 m1，摇匀，即得。本液应临用配制。 (3)氢氧化钠滴定液(O．5mol／L)的配制及标定 取氢氧化钠适量，加水搅拌使 溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静止数日，澄清后，取澄清的 氢氧化钠饱和溶液 28ml，加新煮沸后冷却的水，使成 1000ml，摇匀。 取在 105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约 3g，精密称定，加新沸过的冷 水 50ml，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂 2 滴，用本液滴定；在接近终点 时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色。每 lml 氢氧化钠滴定 液相当于 102．1mg 的邻苯二甲酸氢钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的 取用量，算出本液的浓度。 标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用水定量稀释至每 lml 含 lmg，作为贮备液。精密量取贮备液 2．5ml 置 25ml 量瓶中，用水稀释至刻度，摇 匀，即为每 lml 含 100μg 的标准蛋白质溶液。 测定法 精密量取一定体积供试品(含蛋白质 50μg 左右)置试管内，加水至 lml， 加碱性铜溶液 5ml，摇匀，室温放置 10 分钟，快速加入酚试剂 O．5 ml，摇匀，室 温放置 30 分钟，显色后，照紫外一可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长 650nm 处测 定吸光度(呈色后，如发现浑浊，经每分钟 3000 转离心 15 分钟后，取上清液测定)。 精密量取标准蛋白质溶液 0．2ml、O．4ml、O．6ml、0．8ml、1．0m1 分别置于试管 中，自"加水至 Iml"0，同法操作。准确量取水 lml，自“加碱性铜溶液 5ml”起，同法 操作，作空白对照。以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方 程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量
第三法双缩脲法 本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色深 浅与蛋白质含量成正比,利用标准蛋白质溶液作对照,采用紫外一可见分光光 度法测定供试品蛋白质含量 试剂双缩脲试剂。取硫酸铜(CuS04·5HzO3.Og、酒石酸钾钠 (KNaC4H406·4HzO)9.0g、碘化钾5.Og、氢氧化钠24g,加水溶解并稀释至1000ml 摇匀,即得。 标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量,用水定量稀释成 每Im含50mg的溶液 供试品溶液的制备精密量取适量的供试品,加水制成每lml约含50mg的溶 液 测定法分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0.05m置玻璃试管中, 分别加双缩脲试剂4.0ml,混匀,置37℃水浴中30分钟,照紫外一可见分光光 度法(附录ⅡA),在波长540mm处测定吸光度。另精密量取水0.05m,自"加双缩 脲试剂4.0m"起,同法操作,作为空白对照 按下式计算 蛋白质含量(mg/ml)=A1*C*n/A2 式中A1为供试品溶液的吸光度 A2为标准蛋白质溶液的吸光度 c为标准蛋白质溶液的浓度,mg/ml; n为供试品稀释倍数 【附注】本法的测定范围为1~10mg 页码数:2005版药典附录第22页 附录ⅣD等电聚 焦电泳法 两性电解质在电泳场中形成一个pH梯度,由于蛋白质为两性化合物,其所 带的电荷与介质的pH值有关,带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移, 当到达其等电点(此处的pH值使相应的蛋白质不再带电)时,电流达到最小,不 再移动。本法用于检测蛋白类供试品的等电点。 第一法等电聚焦垂直板电泳 试剂(1)水(电阻率不低于18.2Mg·cm) (2)A液称取丙烯酰胺29.lg、亚甲基双丙烯酰胺0.9g,加适量水溶解,并 稀 释至100m,双层滤纸滤过,避光保存 (3)B液10%过硫酸铵溶液,临用前配制 (4)供试品缓冲液(4倍浓度)量取甘油8ml、40%两性电解质(pH3~10)溶液 加水至20m。加0.1%甲基红溶液20μl (5)固定液称取三氯醋酸34.5g,磺基水杨酸10.4g,加水溶解并稀释至300 (6)脱色液(平衡液)量取95%乙醇500ml、冰醋酸160ml,加水稀释至2000ml
第三法双缩脲法 本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与 Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深 浅与蛋白质含量成正比，利用标准蛋白质溶液作对照，采用紫外一可见分光光 度法测定供试品蛋白质含量。 试剂 双缩脲试剂。取硫酸铜(CuS04·5HzO)3．Og、酒石酸钾钠 (KNaC4H4 06·4HzO)9．0g、碘化钾 5．Og、氢氧化钠 24g，加水溶解并稀释至 1000ml， 摇匀，即得。 标准蛋白质溶液的制备精密量取人血白蛋白标准品适量，用水定量稀释成 每 lml 含 50mg 的溶液。 供试品溶液的制备 精密量取适量的供试品，加水制成每 lml 约含 50mg 的溶 液。 测定法 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各 0．05ml 置玻璃试管中， 分别加双缩脲试剂 4．0ml，混匀，置 37℃水浴中 30 分钟，照紫外一可见分光光 度法(附录ⅡA)，在波长 540nm 处测定吸光度。另精密量取水 0．05ml，自"加双缩 脲试剂 4．0ml"起，同法操作，作为空白对照。 按下式计算 蛋白质含量(mg／m1)=A1*C*n/A2 式中 A1 为供试品溶液的吸光度； A2 为标准蛋白质溶液的吸光度； c 为标准蛋白质溶液的浓度，mg／ml； n 为供试品稀释倍数。 【附注】 本法的测定范围为 1～10mg。 页码数： 2005 版药典附录第 22 页 附录ⅣD 等电聚 焦电泳法 两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所 带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移， 当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电)时，电流达到最小，不 再移动。本法用于检测蛋白类供试品的等电点。 第一法等电聚焦垂直板电泳 试剂 (1)水(电阻率不低于 18．2MΩ·cm) (2)A 液称取丙烯酰胺 29．1g、亚甲基双丙烯酰胺 0．9g，加适量水溶解，并 稀 释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。 (3)B 液 10％过硫酸铵溶液，临用前配制。 (4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 量取甘油 8ml、40％两性电解质(pH3～10)溶液 4ml， 加水至 20ml。加 0．1％甲基红溶液 20μl。 ． (5)固定液 称取三氯醋酸 34．5g，磺基水杨酸 10．4g，加水溶解并稀释至 300 ml。 (6)脱色液(平衡液) 量取 95％乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至 2000ml
(⑦)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g,加脱色液300ml,在60~ 70℃水 浴中加热,使溶解。 (8)保存液量取甘油30ml,加脱色液300ml,混匀 (9)正极液(O.0lmol/L磷酸溶液)量取磷酸lm,加水至1800ml。 (10)负极液(0.01mol/L氢氧化钠溶液)称取氢氧化钠0.4g,加少量水溶 后,加水至1000ml 供试品溶液的制备供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后,与供试品缓冲液 按3:1混匀(供试品溶液最终浓度应在每lm含0.5mg以上,如供试品浓度太低, 则需要采用适当方法浓缩) 测定法装好垂直平板电泳槽,压水,于玻璃板和玻璃纸之间加入60%甘油 ml。取水12ml、甘油2ml、A液4.0ml、两性电解质(pH3~10)溶液(或其他两性电解 质)1.Oml,混匀,脱气,再加B液72pl,N,N,N※,N※一四甲基乙二胺3μl,混 匀后注入槽内聚合1小时。每孔加供试品缓冲液20μ1,接通冷却循环水,于lo℃ 250v(约10mA)条件下电泳30分钟。每孔加样20μl。于10~C500V(约10mA),上限电 2000V条件下,电泳约3.5小时。同时做等电点标准。电泳结束后,即将凝胶放 入固定液中固定20分钟以上,取出,放入平衡液中20~30分钟,再放人染色液中 40~60分钟,然后用脱色液浸洗至背景无色,取出放人保存液中30分钟。亦可做 成干胶保存。根据标准品的等电点(pl对其相应的迁移距离作直线回归,将供试 品的迁移距离代入直线回归方程,求出供试品的等电点。 第二法等电聚焦水平板电泳 试剂(1)水(电阻率应不低于18M·cm)附录ⅤApH值测定法 (2)A液称取丙烯酰胺29.lg、亚甲基双丙烯酰胺O.9g,加适量水溶解,并 稀 释至100m,双层滤纸滤过,避光保存。 ③3)B液10%过硫酸铵溶液,临用前配制 (4)固定液称取三氯醋酸34.5g、磺基水杨酸10.4g,加水溶解并稀释至 300m (5)脱色液(平衡液)量取95%乙醇500ml冰醋酸160ml,加水稀释至2000ml (6染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g,加脱色液300ml,在60~ 70℃水 浴中加热,使溶解 (7)保存液量取甘油30ml,加脱色液300ml,混匀 (8)正极液(O.5tool/L磷酸溶液)量取磷酸50m,加水至1800ml (9)负极液(O.2mol/L氢氧化钠溶液)称取氢氧化钠8g,加水溶解并稀释 供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐,并使蛋白质含量 调节至每lml含0.5mg以上附录ⅤApH值测定法(如供试品蛋白浓度太低,则需采 用适当方法浓缩) 测定法取A液6.25ml,pH3~10两性电解质(或其他两性电解质)l5m,水 17.1ml,抽气5~10分钟,加B液175μ1,N,N,N※N※一四甲基乙二胺20ul
(7)染色液 称取考马斯亮蓝 G250(或 R250)0．35g，加脱色液 300ml，在 60～ 70℃水 浴中加热，使溶解。 (8)保存液 量取甘油 30ml，加脱色液 300ml，混匀。 (9)正极液(O．01mol／L 磷酸溶液) 量取磷酸 lml，加水至 1800ml。 (10)负极液(0．01mol／L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠 0．4g，加少量水溶 解 后，加水至 1000ml。 供试品溶液的制备供试品对水透析(或用其他方法)脱盐后，与供试品缓冲液 按 3：1 混匀(供试品溶液最终浓度应在每 lml 含 0．5mg 以上，如供试品浓度太低， 则需要采用适当方法浓缩)。 测定法装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃 纸之间加入 60％甘油 lml。取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4．0ml、两性电解质(pH3～10)溶液(或其他两性电解 质)1．0ml，混匀，脱气，再加 B 液 72μl，N，N，N※，N※一四甲基乙二胺 3μl，混 匀后注入槽内聚合 1 小时。每孔加供试品缓冲液 20μl，接通冷却循环水，于 lo℃ 250v(约 10mA)条件下电泳 30 分钟。每孔加样 20μl。于 10~C 500V(约 10mA)，上限电 压 2000V 条件下，电泳约 3．5 小时。同时做等电点标准。电泳结束后，即将凝胶放 入固定液中固定 20 分钟以上，取出，放入平衡液中 20～30 分钟，再放人染色液中 40～60 分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放人保存液中 30 分钟。亦可做 成干胶保存。根据标准品的等电点(pI 对其相应的迁移距离作直线回归，将供试 品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。 第二法等电聚焦水平板电泳 试剂 (1)水(电阻率应不低于 18MΩ·cm)附录 V A pH 值测定法 (2)A 液称取丙烯酰胺 29．1g、亚甲基双丙烯酰胺 O．9g，加适量水溶解，并 稀 释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。 (3)B 液 10％过硫酸铵溶液，临用前配制。 (4)固定液 称取三氯醋酸 34．5g、磺基水杨酸 10．4g，加水溶解并稀释至 300ml。 (5)脱色液(平衡液) 量取95％乙醇500ml、冰醋酸160ml，加水稀释至2000ml。 (6)染色液 称取考马斯亮蓝 G250(或 R250)0．35g，加脱色液 300ml，在 60～ 70℃水 浴中加热，使溶解。 (7)保存液 量取甘油 30ml，加脱色液 300ml，混匀。 (8)正极液(O．5tool／L 磷酸溶液) 量取磷酸 50ml，加水至 1800ml。 (9)负极液(O．2mol／L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠 8g，加水溶解并稀释 至 1000ml。 供试品溶液的制备将供试品对水透析(或用其他方法)脱盐，并使蛋白质含量 调节至每 lml 含 0．5mg 以上附录 V A pH 值测定法(如供试品蛋白浓度太低，则需采 用适当方法浓缩)。 测定法取 A 液 6．25ml，pH3～10 两性电解质(或其他两性电解质)1_5ml，水 17．1ml，抽气 5～10 分钟，加 B 液 175 μl，N，N ,N※N※一四甲基乙二胺 20μl
混匀 后缓慢地注入水平模具内,室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却 板上,其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿 正极与负极电极条,然后分别放于阳极与阴极上,将加样滤纸放在凝胶上。加 供试品溶液5~30μl。将电极对准电极条的中心,加盖,在上限电压2000V、上 限电流50mA、功率为每lcm胶IW、温度4℃的电泳条件下,开始电泳,电泳 2.5小时,同时做等电点标准。电泳30分钟后去掉加样滤纸,电泳结束后,即 将凝胶放入固定液中固定20分钟以上,取出放入平衡液20~30分钟,再放人染色 液40~60分钟,然后用脱色液浸洗至背景无色,取出放人保存液中30分钟,晾 干。亦可做成干胶永久保存。根据标准品的等电点(p)对其相应的迁移距离作直 线回归:将供试品的迁移距离代入直线回归方程,求出供试品的等电点 页码数:2005版药典附录第20页 附 录IV电泳法 电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋 酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场的作用下,带电粒子 按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动,使组分分离成狭窄的区带 用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外, 各电泳法,照下述方法操作 书页号:2005版药典三部附录12页 附录Ⅱ 分光光度法 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度 或发光强度,对该物质进行定性和定量分析的方法 常用的波长范围为:(1)200~400hm的紫外光区:(2)400~760hm的可见光区 (3)2.5~25um(按波数计为4000-400cm-1)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度 计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为 保证测量的精密度和准确度所用仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定 定期进行校正检定。 单色光辐射穿过被测物质溶液时,在一定的浓度范围内被该物质吸收的量 与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比,其关系如下式 A=lgl/T=ECL 式中A为吸光度 T为透光率 E为吸收系数,采用的表示方法是E1%lCM,其物理意义为当溶液浓度为1% (g/m1),液层厚度为lcm时的吸光度数值 C为l0oml溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算),g; L为液层厚度,cm
混匀 后缓慢地注入水平模具内，室温下聚合。将已聚合的聚丙烯酰胺凝胶放在冷却 板上，其间涂以液体石蜡或煤油并避免产生气泡。用正极液与负极液分别润湿 正极与负极电极条，然后分别放于阳极与阴极上，将加样滤纸放在凝胶上。加 供试品溶液 5～30μl。将电极对准电极条的中心，加盖，在上限电压 2000V、上 限电流 50mA、功率为每 1cm 胶 1W、温度 4℃的电泳条件下，开始电泳，电泳 2．5 小时，同时做等电点标准。电泳 30 分钟后去掉加样滤纸，电泳结束后，即 将凝胶放入固定液中固定 20 分钟以上，取出放入平衡液 20～30 分钟，再放人染色 液 40～60 分钟，然后用脱色液浸洗至背景无色，取出放人保存液中 30 分钟，晾 干。亦可做成干胶永久保存。根据标准品的等电点(pI)对其相应的迁移距离作直 线回归；将供试品的迁移距离代入直线回归方程，求出供试品的等电点。 页码数： 2005 版药典附录第 20 页 附 录 IV 电泳法 电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如纸、醋 酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中，在电场的作用下，带电粒子 按各自的速度向极性相反的电极方向进行泳动，使组分分离成狭窄的区带， 用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量的方法。除另有规定外， 各电泳法，照下述方法操作。 书页号：2005 版药典三部附录 12 页 附录Ⅱ 分光光度法 分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内的吸光度 或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。 常用的波长范围为： (1)200～400hm 的紫外光区；(2)400～760hm 的可见光区； (3)2．5～25μm(按波数计为 4000～400cm-1)的红外光区。所用仪器为紫外分光光度 计、可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为 保证测量的精密度和准确度所用仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定， 定期进行校正检定。 单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量 与该物质的浓度和液层的厚度(光路长度)成正比，其关系如下式： A=1g1/T=ECL 式中 A 为吸光度； T 为透光率； E 为吸收系数，采用的表示方法是 E1％1CM，其物理意义为当溶液浓度为 1％ (g／m1)，液层厚度为 lcm 时的吸光度数值； C 为 100ml 溶液中所含被测物质的重量(按干燥品或无水物计算)，g； L 为液层厚度，cm
物质对光的选择性吸收波长,以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。 当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后,可用同样条件将该供试品配成溶 液,测定其吸光度,即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区 除某些物质对光有吸收外,很多物质本身并没有吸收,但可在一定条件下加入 显色试剂或经过处理使其显色后再测定,故又称比色分析 页码数:2005版药典附录第19页 附录ⅢD分子排阻色 谱法 分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术 分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅 胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶( Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶( Sepharose)等为 填充剂,这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径,药物分子进入色谱柱后,它 们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内,大于所有孔径的分子不能进 入填充剂颗粒内部,在色谱过程中不被保留,最早被流动相洗脱至柱外,表现 为保留时间较短:小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径,在 色谱柱中滞留时间较长,表现为保留时间较长:其余分子则按分子大小依次被 洗脱 1.对仪器的一般要求 分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法,液相色谱泵 般分常压、中压和高压。在药物分析中,尤其是分子量或分子量分布测定中 通常采用高效分子排阻色谱法( HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱 柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液,溶液的pH值不宜超出填充剂 的耐受力,一般pH值在2~8范围。流动相中可加入适量的有机溶剂,但不宜过 浓,一般不应超过30%,流速不宜过快,一般每分钟为0.5~1.0ml。 2.系统适用性试验 高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重 复性、拖尾因子的测定方法,在一般情况下,同高效液相色谱法项下方法,但 在高分子杂质检查时,某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时 其分离度的计算公式为:R=二聚体的峰高/单体与二聚体之间的谷高 除另有规定外,分离度应大于2.0。 3.测定法 (1)分子量测定法 般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法,选用与 供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品,除另有规定外, 对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DIT和十二烷基硫酸钠(SDS)处理,以打 开分子内和分子间的二硫键,并使分子的构型与构象趋于一致,经处理的蛋白 质和多肽分子通常以线性形式分离,以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保 留时间(R)制得标准曲线的线性回归方程lMw=a+btR,供试品以保留时间由标准 曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。 (2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法 生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均
物质对光的选择性吸收波长，以及相应的吸收系数是该物质的物理常数。 当已知某纯物质在一定条件下的吸收系数后，可用同样条件将该供试品配成溶 液，测定其吸光度，即可由上式计算出供试品中该物质的含量。在可见光区， 除某些物质对光有吸收外，很多物质本身并没有吸收，但可在一定条件下加入 显色试剂或经过处理使其显色后再测定，故又称比色分析。 页码数： 2005 版药典附录第 19 页 附录ⅢD 分子排阻色 谱法 分子排阻色谱法是根据待测组分的分子大小进行分离的一种液相色谱技术。 分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制。色谱柱多以亲水硅 胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶(Sephadex)和聚丙烯酰胺凝胶(Sepharose)等为 填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它 们中的不同组分按其分子大小进入相应的孔径内，大于所有孔径的分子不能进 入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现 为保留时间较短；小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在 色谱柱中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被 洗脱。 1．对仪器的一般要求 分子排阻色谱法所需的进样器和检测器同高效液相色谱法，液相色谱泵一 般分常压、中压和高压。在药物分析中，尤其是分子量或分子量分布测定中， 通常采用高效分子排阻色谱法(HPSEC)。应选用与供试品分子大小相适应的色谱 柱填充剂。使用的流动相通常为水溶液或缓冲液，溶液的 pH 值不宜超出填充剂 的耐受力，一般 pH 值在 2～8 范围。流动相中可加入适量的有机溶剂，但不宜过 浓，一般不应超过 30％，流速不宜过快，一般每分钟为 0．5～1．0ml。 2．系统适用性试验 高效分子排阻色谱法的系统适用性试验中色谱柱的理论板数(n)、分离度、重 复性、拖尾因子的测定方法，在一般情况下，同高效液相色谱法项下方法，但 在高分子杂质检查时，某些药物分子的单体与其二聚体不能达到基线分离时， 其分离度的计算公式为： R=二聚体的峰高/单体与二聚体之间的谷高 除另有规定外，分离度应大于 2．0。 3．测定法 （l）分子量测定法 一般适用于蛋白质多肽的分子量测定。按各品种项下规定的方法，选用与 供试品分子大小相适宜的色谱柱和适宜分子量范围的对照品，除另有规定外， 对照品与供试品均需使用二硫苏糖醇(DTT)和十二烷基硫酸钠(SDS)处理，以打 开分子内和分子间的二硫键，并使分子的构型与构象趋于一致，经处理的蛋白 质和多肽分子通常以线性形式分离，以对照品分子量(Mw)的对数值对相应的保 留时间(tR)制得标准曲线的线性回归方程 lgMw=a+btR，供试品以保留时间由标准 曲线回归方程计算其分子量或亚基的分子量。 (2)生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法 生物大分子聚合物如多糖、多聚核苷酸和胶原蛋白等具有分子大小不均一