《药学》课程教学资源（书籍文献）《中国药典》2005年版3部附录

中国药典三部附录(2005年版) 135种 页码数:2005版药典附录第44页 附录ⅥGA群脑膜炎球菌多糖 第一法测磷法(仲裁法) 本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定KD值 以前的回收率。 试剂(1)流动相取氯化钠11.7g、叠氮钠0.1g,加水使溶解成1000m,混匀 用O.lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.O (②)蓝色葡聚糖2000溶液取蓝色葡聚糖200020mg,加流动相使溶解成10ml (3)维生素B12溶液称取l0mg维生素B12,加流动相使溶解成10ml 色谱柱的制备取琼脂糖4B凝胶或琼脂糖CL-4B凝胶约200m,加流动相400m充分 搅拌,放置约1小时使其沉淀,倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复3~5次 后,加流动相200ml,混匀,抽去凝胶中的空气,装于1.5m×90cm色谱柱中,约 87cm高,,用流动相洗脱,流速为每小时15~20ml,以2~3倍柱床体积的流动相 洗脱(约500m1),使柱床平衡。 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lm加于已平衡的色谱柱中,以流动相洗 脱,流速每小时15~20ml,用组分收集器收集洗脱液,每管收集3~5ml,照紫外 可见分光光度法(附录ⅡA),在波长260m处测定各管洗脱液的吸光度,以吸光 度为纵坐标,洗脱液体积(m1)为横坐标分别作图,260nm波长处的峰顶洗脱液体 积为空流体积V0 取维生素B12溶液lml,自“加于已平衡的色谱柱中起,同法操作,370nm波长处 的峰顶洗脱液体积为柱床体积ⅵ 测定法取供试品约lml(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解),加 于已标定的色谱柱中,用流动相洗脱,用组分收集器收集洗脱液,每管收集5ml 照磷含量测定法(附录ⅦA测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷 含量为纵坐标,洗脱液体积(m1)为横坐标作图,主峰峰顶洗脱液体积为vs 按下式计算 KD=ve-vO/Vi-V0。 式中KD为供试品分配系数 ve为供试品洗脱液体积,ml; V0为空流体积 Ⅵ为柱床体积 计算供试品在KD值<0.5的多糖回收率 Rx(%=Ax/At×100% 式中Rx为KD值<O.5供试品的多糖回收率 Ax为供试品在KD值<O.5各管洗脱液的磷含量之和; At为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。 第二法仪器法 试剂与色谱柱的制备同第一法 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖2000溶液lml与维生素B1溶液0.2m,混匀后加于 已平衡的色谱柱中,以流动相洗脱,流速每小时15~20m,检测波长206nm,用 组分收集器收集洗脱液,记录色谱图,色谱图中,第一峰为蓝色葡聚糖2000峰

中国药典三部附录（2005 年版） 135 种 页码数： 2005 版药典附录第 44 页 附录 VI G A 群脑膜炎球菌多糖 第一法测磷法(仲裁法) 本法用于测定细菌荚膜多糖在色谱柱中的分配系数(KD)和多糖在规定 KD 值 以前的回收率。 试剂 (1)流动相取氯化钠 11．7g、叠氮钠 0．1g，加水使溶解成 1000ml，混匀， 用 O．1mol／L 氢氧化钠溶液调节 pH 至 7．O。 (2)蓝色葡聚糖 2000 溶液 取蓝色葡聚糖 2000 20mg，加流动相使溶解成 10ml。 (3)维生素 B12 溶液称取 10mg 维生素 B12，加流动相使溶解成 10ml。 色谱柱的制备取琼脂糖 4B 凝胶或琼脂糖 CL-4B 凝胶约 200ml，加流动相 400ml 充分 搅拌，放置约 1 小时使其沉淀，倾去上层含悬浮颗粒的悬液。如此反复 3～5 次 后，加流动相 200ml，混匀，抽去凝胶中的空气，装于 1．5cm×90cm 色谱柱中，约 87cm 高，．用流动相洗脱，流速为每小时 15～20ml，以 2～3 倍柱床体积的流动相 洗脱(约 500m1)，使柱床平衡。 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖 2000 溶液 lml 加于已平衡的色谱柱中，以流动相洗 脱，流速每小时 15～20ml，用组分收集器收集洗脱液，每管收集 3～5ml，照紫外 -可见分光光度法(附录ⅡA)，在波长 260nm 处测定各管洗脱液的吸光度，以吸光 度为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标分别作图，260nm 波长处的峰顶洗脱液体 积为空流体积 V0。 取维生素 B12 溶液 lml，自“加于已平衡的色谱柱中起，同法操作，370nm 波长处 的峰顶洗脱液体积为柱床体积 Vi。 测定法取供试品约 lml(含多糖抗原 3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)，加 于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，用组分收集器收集洗脱液，每管收集 5ml， 照磷含量测定法(附录ⅦA)测定每管洗脱液的磷含量。以供试品每管洗脱液的磷 含量为纵坐标，洗脱液体积(m1)为横坐标作图，主峰峰顶洗脱液体积为 Ve。 按下式计算 KD=ve-v0/Vi-V0。 式中 KD 为供试品分配系数； Ve 为供试品洗脱液体积，ml； V0 为空流体积，ml； Vi 为柱床体积，ml。 计算供试品在 KD 值<0．5 的多糖回收率 Rx(％)=Ax/At×100％ 式中 Rx 为 KD 值<O．5 供试品的多糖回收率； Ax 为供试品在 KD 值<O．5 各管洗脱液的磷含量 之和； At 为供试品所有管洗脱液的磷含量之和。 第二法仪器法 试剂与色谱柱的制备同第一法。 色谱柱的标定取蓝色葡聚糖 2000 溶液 lml 与维生素 B12 溶液 0．2ml，混匀后加于 已平衡的色谱柱中，以流动相洗脱，流速每小时 15～20ml，检测波长 206nm，用 组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，色谱图中，第一峰为蓝色葡聚糖 2000 峰

峰顶的洗脱液体积为空流体积ⅴo:第二峰为维生素B12的峰,峰顶的洗脱液体积 为柱床体积Vi 测定法取供试品约lm(含多糖抗原3~5mg,如为冻干制品可用流动相溶解), 加于已标定的色谱柱中,用流动相洗脱,流速为每小时15~20m,检测波长 206nm,用组分收集器收集洗脱液,记录色谱图,即得。 按下式计算 KD=Ve- VO/Vi-VO 式中KD为供试品分配系数 V为供试品洗脱液体积,ml K为空流体积,m1 Ⅵ为柱床体积,ml 计算供试品在KD值<O.5多糖回收率 Rx(%)=Ax/At*100% 式中凡为KD值<O.5供试品的多糖回收率(%) Ax为供试品在KD值<O.5的色谱图面积; A0为供试品色谱图总面积 【附注】过柱操作在10~20℃进行。 书页号:2005版药典三部附录71页 附录ⅪKIgG含 量测定法 (紫外-可见分光 光度法) 本法系依据免疫球蛋白G(gG)与相应的抗体特异性结合后,在适宜的电解 质、温度、pH条件下,产生凝集反应,形成抗原抗体复合物,根据供试品的吸 光度求出供试品中1gG的含量。 试剂(1)缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷(Iris)l242g、氯化钠9g、聚乙二醇 (PEG600050g、牛血清白蛋白(BSA)lg、叠氮钠(NaN3)lg,加水溶解,用10mo/L盐酸调 pH至74,加水稀释至1000ml (2)抗人lgG血清按说明书要求将冻干抗人lgG血清复溶,按标示效价取 量抗人IgG血清,加缓冲液稀释至抗体最终效价为1:4(例如,抗人IgG血清效价为 l:100,取原液2ml加抗体缓冲液48m),充分混匀,0.45μm膜过滤。4℃保存备用 lgG标准品溶液的制备用生理氯化钠溶液将IgG标准品在每lml含02~6·Omg范围内做 适当的系列稀释(通常做5个稀释度) 供试品溶液的制备用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低3个稀释 度,其lgG含量均应在标准曲线范围内 测定法取供试品溶液10μl,加已预热至37℃的抗体液1m,混匀,每个稀释 度 做2管,37℃水浴中保温1小时,充分混匀,照紫外-可见分光光度法(附录ⅡA), 于波长340nm处分别测定吸光度 用lgG标准品溶液10μ替代供试品溶液,同法操作

峰顶的洗脱液体积为空流体积 V0；第二峰为维生素 B12 的峰，峰顶的洗脱液体积 为柱床体积 Vi。 测定法取供试品约 lml(含多糖抗原 3～5mg，如为冻干制品可用流动相溶解)， 加于已标定的色谱柱中，用流动相洗脱，流速为每小时 15～20 ml，检测波长 206nm，用组分收集器收集洗脱液，记录色谱图，即得。 按下式计算 KD=Ve-V0/Vi-V0 式中 KD 为供试品分配系数； V 为供试品洗脱液体积，ml, K 为空流体积，m1； Ⅵ为柱床体积，ml。 计算供试品在 KD 值<O．5 多糖回收率 Rx(％)=Ax/At*100％ 式中凡为 KD 值<O．5 供试品的多糖回收率(％)； Ax 为供试品在 KD 值<O．5 的色谱图面积； A0 为供试品色谱图总面积。 【附注】 过柱操作在 10～20℃进行。 书页号：2005 版药典三部附录 71 页 附录Ⅺ K IgG 含 量测定法 (紫外-可见分光 光度法) 本法系依据免疫球蛋白 G(IgG)与相应的抗体特异性结合后，在适宜的电解 质、温度、pH 条件下，产生凝集反应，形成抗原抗体复合物，根据供试品的吸 光度求出供试品中 IgG 的含量。 试剂 (1) 缓冲液 称取三羟甲基氨基甲烷(Tris)12.42g、氯化钠 9g、聚乙二醇 (PEG 6000)50g、牛血清白蛋白(BSA)1g、叠氮钠(NaN3)1g，加水溶解，用 1.0mol/L 盐酸调 pH 至 7.4，加水稀释至 1000ml。 (2) 抗人 IgG 血清 按说明书要求将冻干抗人 IgG 血清复溶，按标示效价取一 定 量抗人 IgG 血清，加缓冲液稀释至抗体最终效价为 1：4(例如，抗人 IgG 血清效价为 1：100，取原液 2ml 加抗体缓冲液 48ml)，充分混匀，0.45μm 膜过滤。4℃保存备用。 IgG 标准品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将 IgG 标准品在每 1ml 含 0.2～6.0mg 范围内做 适当的系列稀释(通常做 5 个稀释度)。 供试品溶液的制备 用生理氯化钠溶液将供试品稀释成高、中、低 3 个稀释 度，其 IgG 含量均应在标准曲线范围内。 测定法 取供试品溶液 10μl，加已预热至 37℃的抗体液 1ml，混匀，每个稀释 度 做 2 管，37℃水浴中保温 1 小时，充分混匀，照紫外-可见分光光度法(附录Ⅱ A)， 于波长 340nm 处分别测定吸光度。 用 IgG 标准品溶液 10μl 替代供试品溶液，同法操作

计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值。将标准品溶液的IgC 含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归,相关系数应不低于0.99;然 后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程,求得值的反对数,再乘以稀释 倍数,求取每lm供试品溶液lgG含量(gL),再由供试品各稀释度IgG含量求平均值, 即为供试品IgG含量(g/L) 【附注】(1)全部反应管必须在10分钟内测量完毕 (2)设置紫外分光光度计狭缝宽度 Slit width)为2nm (3)每次测定可根据供试品IgG含量,适当调整标准品溶液中IgG含量范围 页码数:2005版药典附录第32页 附录ⅥF0一乙酰基测 定法 试剂(1)2mo/L盐酸羟胺溶液称取盐酸羟胺13.9g,加水溶解并稀释至IOO m,冷处保存 (2)3.5mol/L氢氧化钠溶液称取氢氧化钠14.Og,加水使溶解并稀释至10oml (3)}4mol/L盐酸溶液量取盐酸33.3ml,加水稀释至 lOOm的溶液 (4)0.37mol/L三氯化铁一盐酸溶液称取三氯化铁(FeCl3·6H20)10.Og,加 O.lmol/L盐酸溶液溶解并稀释至100m。 (5)碱性羟胺溶液取等体积的盐酸羟胺溶液(mol/L)与氢氧化钠溶液 (3.5mol/L混合。3小时内使用 对照品溶液的制备精密称取已干燥至恒重的氯化乙酰胆碱2.7mg(或溴化乙 酰胆碱28.3mg),置5oml量瓶中,加0.00lmol/L醋酸钠溶液(pH4.5)溶解并稀释 至刻度,摇匀。 供试品溶液的制备取供试品,用水稀释成O-乙酰基浓度为O.5~2.5mmol/L 的溶液。 测定法精密量取氯化乙酰胆碱(或溴化乙酰胆碱)对照品溶液O.2ml、0.4m、 O.6ml、O.8ml、1Om,分别置试管中,补加水至lml,加新鲜配制的碱性羟胺 溶液2m,摇匀,于室温放置4分钟,加4mol/L盐酸lm,调pH值至1.2±O.2,摇 匀,加O.37mol/L三氯化铁一盐酸溶液lm,摇匀,照紫外一可见分光光度法(附 录ⅡA),在波长540m处测定吸光度。另精密量取上述相应的系列对照品溶液, 自“补加水至lm※’起,除加酸与加碱性羟胺的次序颠倒外,同法操作,用作对应 的空白对照。 精密量取供试品溶液ln置试管中,自“加新鲜配制的碱性羟胺溶液2m※’起,同 法操作。并取供试品溶液Iml,同法操作,用作供试品的空白对照 将标准管各吸光度分别减去相应的空白对照管的吸光度,以标准管中所含的 对照品溶液的体积与对应的吸光度作直线回归,将供试品的吸光度减去供试品 溶液空白吸光度代入直线回归方程,计算出每Im供试品相当于对照品溶液的体 积( 供试品中O-乙酰基含量(mm0l/L)=E×2.5式中2.5为对照品溶液中乙酰胆碱的 含量(mmol/L)

计算标准品和供试品不同稀释度溶液的吸光度的均值。将标准品溶液的 IgG 含量的对数对其相应的吸光度的对数进行直线回归，相关系数应不低于 0.99；然 后将供试品溶液吸光度的对数值代入回归方程，求得值的反对数，再乘以稀释 倍数，求取每 1ml 供试品溶液 IgG 含量(g/L)，再由供试品各稀释度 IgG 含量求平均值， 即为供试品 IgG 含量(g/L)。 【附注】 (1) 全部反应管必须在 10 分钟内测量完毕。 (2) 设置紫外分光光度计狭缝宽度(Slit Width)为 2nm。 (3) 每次测定可根据供试品 IgG 含量，适当调整标准品溶液中 IgG 含量范围。 页码数： 2005 版药典附录第 32 页 附录ⅥF 0 一乙酰基测 定法 试剂 (1)2mol／L 盐酸羟胺溶液 称取盐酸羟胺 13．9g，加水溶解并稀释至 lOO ml，冷处保存。 (2)3．5mol／L 氢氧化钠溶液称取氢氧化钠 14．Og，加水使溶解并稀释至 100ml。 (3)4mol／L 盐酸溶液量取盐酸 33．3ml，加水稀释至 lOOml 的溶液。 (4)0．37mol／L 三氯化铁一盐酸溶液 称取三氯化铁(FeCl3·6H20)10．Og，加 O．1mol／L 盐酸溶液溶解并稀释至 100ml。 (5)碱性羟胺溶液 取等体积的盐酸羟胺溶液(2mol／L)与氢氧化钠溶液 (3．5mol／L)混合。3 小时内使用。 对照品溶液的制备精密称取已干燥至恒重的氯化乙酰胆碱 22．7mg(或溴化乙 酰胆碱 28．3mg)，置 50ml 量瓶中，加 0．001mol／L 醋酸钠溶液(pH4．5)溶解并稀释 至刻度，摇匀。 供试品溶液的制备 取供试品，用水稀释成 O-乙酰基浓度为 O．5～2．5mmol／L 的溶液。 测定法精密量取氯化乙酰胆碱(或溴化乙酰胆碱)对照品溶液 O．2ml、0．4ml、 O．6ml、O．8ml、1_Oml，分别置试管中，补加水至 lml，加新鲜配制的碱性羟胺 溶液 2ml，摇匀，于室温放置 4 分钟，加 4mol／L 盐酸 lml，调 pH 值至 1．2±O．2，摇 匀，加 O．37mol／L 三氯化铁一盐酸溶液 lml，摇匀，照紫外一可见分光光度法(附 录ⅡA)，在波长 540nm 处测定吸光度。另精密量取上述相应的系列对照品溶液， 自“补加水至 lml※’起，除加酸与加碱性羟胺的次序颠倒外，同法操作，用作对应 的空白对照。 精密量取供试品溶液 Iml 置试管中，自“加新鲜配制的碱性羟胺溶液 2ml※’起，同 法操作。并取供试品溶液 Iml，同法操作，用作供试品的空白对照。 将标准管各吸光度分别减去相应的空白对照管的吸光度，以标准管中所含的 对照品溶液的体积与对应的吸光度作直线回归，将供试品的吸光度减去供试品 溶液空白吸光度代入直线回归方程，计算出每 Iml 供试品相当于对照品溶液的体 积(E，m1)。 供试品中 O-乙酰基含量(mm01／L)=E×2．5 式中 2．5 为对照品溶液中乙酰胆碱的 含量(mmol／L)

页码数:2005版药典附录第22页 附录ⅣCSDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳法 大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复 合物,使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷,消除了 不同蛋白质分子的电荷效应,使蛋白质按分子大小分离 仪器恒压或恒流电源,垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具 试剂(1)水(电阻率不低于18.2Mg.cm) (2)A液1.5mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲 烷18.15g,加适量水溶解,用盐酸调pH值至8.8,加水稀释至100ml (3)B液30%丙烯酰胺一0.8%N,N’一亚甲基双丙烯酰胺溶液(避光保存)。 (4C液1%十二烷基硫酸钠溶液。 (5)D液10%四甲基乙二胺溶液。 (6E液10%过硫酸铵溶液,临用前配制。 (刀F液O.5mol/L三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲 烷6.05g加适量水溶解,用盐酸调pl值至6.8,加水稀释至100ml (8)电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷3g、甘氨酸144g、十二烷基硫酸钠1g, 加适量水溶解,用盐酸调pH值至8.3,加水稀释至1000ml。 (9)供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷O.303g、溴酚蓝2mg、十二烷基硫 酸钠O.8g,量取盐酸0.189m、甘油4ml,加水溶解并稀释至10m,此溶液用于非 还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,如用于还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,则再加 B-巯基乙醇2ml (10)分子量标准供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内 (11)固定液量取甲醇250ml、冰醋酸60ml,加水稀释至500ml (12)漂洗液量取乙醇100m、冰醋酸50m,加水稀释至1000m。 (13辅染液称取重铬酸钾10g,量取硝酸2ml加适量水溶解并稀释至200ml 用 前40倍稀释。 (14)银染液称取硝酸银2.04g,加水溶解并稀释至1000ml (15显色液称取碳酸钠30g加适量水溶解,加甲醛O.5m,并稀释至1000ml。 (16)终止液量取冰醋酸10ml加水稀释至1000m (1考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝R250lg,加入甲醇200ml、冰醋 酸 50m、水250m混匀。 页码数:2005版药典附录第50页 附录ⅨHSV40核酸序 列检查法 本法系通过设计两对特异引物扩增SV40VPl100bp(2220~2319)和大T抗原C-末端 4bp(2619~3070两个片段,采用聚合酶链反应(PCR检查供试品中是否存在SV40核 酸序列 供试品溶液及对照溶液的制备取供试品400μ1,加2%蛋白酶K溶液25μ1、10%

页码数： 2005 版药典附录第 22 页 附录ⅣC SDS 一聚丙烯酰胺凝胶电泳法 大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复 合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了 不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。 仪器恒压或恒流电源，垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。 试剂 (1)水(电阻率不低于 18．2MΩ．cm) (2)A 液 1．5mol／L 三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲 液。称取三羟甲基氨基甲 烷 18．15g，加适量水溶解，用 盐酸调 pH 值至 8．8，加水稀释至 100ml。 (3)B 液 30％丙烯酰胺一 0．8％N，N’一亚甲基双丙烯酰胺溶液(避光保存)。 (4)C 液 1％十二烷基硫酸钠溶液。 (5)D 液 10％四甲基乙二胺溶液。 (6)E 液 10％过硫酸铵溶液，临用前配制。 (7)F 液 O．5mol／L 三羟甲基氨基甲烷一盐酸缓冲液。称取三羟甲基氨基甲 烷 6．05g 加适量水溶解，用盐酸调 pH 值至 6．8，加水稀释至 100ml。 (8)电极缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷 3g、甘氨酸 14.4g、十二烷基硫酸钠 1g， 加适量水溶解，用盐酸调 pH 值至 8．3，加水稀释至 1000ml。 (9)供试品缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷 O．303g、溴酚蓝 2mg、十二烷基硫 酸钠 O．8g，量取盐酸 0．189ml、甘油 4ml，加水溶解并稀释至 10ml，此溶液用于非 还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，如用于还原 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，则再加 β-巯基乙醇 2ml。 (10)分子量标准供试品的分子量应包括在使用的分子量标准范围之内。 (11)固定液量取甲醇 250ml、冰醋酸 60ml，加水稀释至 500ml。 (12)漂洗液量取乙醇 100ml、冰醋酸 50ml，加水稀释至 1000m|。 (13)辅染液称取重铬酸钾 10g，量取硝酸 2ml 加适量水溶解并稀释至 200ml。 用 前 40 倍稀释。 (14)银染液称取硝酸银 2．04g，加水溶解并稀释至 1000ml。 (15)显色液称取碳酸钠30g加适量水溶解，加甲醛O．5ml，并稀释至1000ml。 (16)终止液量取冰醋酸 10ml 加水稀释至 1000ml。 (17)考马斯亮蓝染色液称取考马斯亮蓝 R250 1g，加入甲醇 200ml、冰醋 酸 50ml、水 250ml 混匀。 页码数： 2005 版药典附录第 50 页 附录ⅨH SV40 核酸序 列检查法 本法系通过设计两对特异引物扩增 SV40 VPl 100bp(2220～2319)和大 T 抗原 C-末端 451bp(2619～3070)两个片段，采用聚合酶链反应(PCR)检查供试品中是否存在 SV40 核 酸序列。 供试品溶液及对照溶液的制备取供试品 400μ1，加 2％蛋白酶 K 溶液 25μ1、10％

SDS溶液50μl、O.05mol/ L EDTA溶液(pH8.O)10u1,56℃培养1小时,用等体积的 酚 三氯甲烷(1:1)混合液抽提后,再用等体积的三氯甲烷抽提,加2倍体积的乙醇, 20℃放置16小时,以每分钟10000转离心15分钟,沉淀用75%乙醇溶液洗涤干燥 加无DNA酶和RNA酶的水10μ1,使溶解。阳性及阴性对照按上述方法与供试品同 时处理 引物 VPl上游引物:22205※ ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3’2240 VPl下游引物:23195※ GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3’2297 T抗原C末端上游引物:30705※- GAC CTG TGG CTG AGT TIG CTCA-3”3049 T抗原c末端下游引物:26195’ GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3’2 检查法(1)每个待扩增的供试品引物加量为30×10-12mol,DNA模板加量为1ul, 体积50μl。在PCR仪上以94℃先变性3分钟:94℃变性20秒、50℃C退火20秒、72℃ 延 伸40秒共进行40个循环;72℃延伸3分钟。 (2)扩增产物电泳检査:2%琼脂糖凝胶(每lm含1μg溴化乙锭,缓冲液为1×TAE, 在100ⅴ条件下电泳40分钟,检査扩增片段。VPl扩增片段为100bp,大T抗原C末端 片段为45bp 3)以同样模板重复扩增ⅤP片段,排除污染因素导致的非特异扩增;或将扩增 产物及对照从胶上移至 Hybond N尼龙膜上,与ⅤP探针进行免疫印迹试验以证明 所扩增片段确为VPI片段。 (4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大T抗原C末端扩增产物进行序列测 结果判定阳性对照应得到特异产物,阴性对照应无相应片段,则试验成立 若未能扩出VPl片段,则结果判定为未检出SV40核酸序列。 若扩增出VP片段,可重复试验1次,仍未扩增出ⅤP片段者,判定为未检出 SV40核酸序列。 若重试仍能扩增出ⅤP片段,则应扩增大T抗原C-末端片段,如扩增出大T抗原 C-末端片段,则其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较,核酸序列 致判定为检出S40核酸序列:如未扩增出大T抗原C-末端片段,则可按上述步骤 (1)~(3)重复试验1次,如仍未扩增出大T抗原C末端片段,则可判定为未检出 SV40核酸序列。 页码数:2005版药典附录第24页 附录Ⅴ 除另有规定外,水溶液的pH值应以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为 参比电极的酸度计进行测定。酸度计应定期进行计量检定,并符合国家有关规 定。测定前,应采用下列标准缓冲液校正仪器,也可用国家标准物质管理部门 发放的标示pH值准确至0.0lp单位的各种标准缓冲液校正仪器 1.仪器校正用的标准缓冲液

SDS 溶液 50μl、O．05mol／L EDTA 溶液(pH8．O)10μ1，56℃培养 1 小时，用等体积的 酚 -三氯甲烷(1：1)混合液抽提后，再用等体积的三氯甲烷抽提，加 2 倍体积的乙醇， -20℃放置 16 小时，以每分钟 10000 转离心 15 分钟，沉淀用 75％乙醇溶液洗涤干燥， 加无 DNA 酶和 RNA 酶的水 10μl，使溶解。阳性及阴性对照按上述方法与供试品同 时处理。 引物 VPl 上游引物：2220 5※_ACA CAG CAA CCA CAG TGG TTC-3’2240 VPl 下游引物：2319 5※_GTA AAC AGC CCA CAA ATG TCA AC-3’2297 T 抗原 C_末端上游引物：3070 5※-GAC CTG TGG CTG AGT TTG CTC A-3’3049 T 抗原 c_末端下游引物：2619 5’一 GCT TTA TTT GTA ACC ATT ATA AG-3’2641 检查法 (1)每个待扩增的供试品引物加量为 30×10-12 mol，DNA 模板加量为 1μl， 总 体积 50μl。在 PCR 仪上以 94℃先变性 3 分钟；94℃变性 20 秒、50℃C 退火 20 秒、72℃ 延 伸 40 秒共进行 40 个循环；72℃延伸 3 分钟。 (2)扩增产物电泳检查：2％琼脂糖凝胶(每 lml 含 1μg 溴化乙锭)，缓冲液为 1×TAE， 在 100V 条件下电泳 40 分钟，检查扩增片段。VPl 扩增片段为 100bp，大 T 抗原 C_末端 片段为 451bp。 (3)以同样模板重复扩增 VPl 片段，排除污染因素导致的非特异扩增；或将扩增 产物及对照从胶上移至 Hybond N 尼龙膜上，与 VPl 探针进行免疫印迹试验以证明 所扩增片段确为 VPl 片段。 (4)以自动测序仪对供试品及阳性对照的大 T 抗原 C_末端扩增产物进行序列测 定。 结果判定 阳性对照应得到特异产物，阴性对照应无相应片段，则试验成立。 若未能扩出 VPl 片段，则结果判定为未检出 SV40 核酸序列。 若扩增出 VPl 片段，可重复试验 1 次，仍未扩增出 VPl 片段者，判定为未检出 SV40 核酸序列。 若重试仍能扩增出 VPl 片段，则应扩增大 T 抗原 C-末端片段，如扩增出大 T 抗原 C-末端片段，则其扩增产物和阳性对照扩增产物进行测序并比较，核酸序列一 致判定为检出 SV40 核酸序列；如未扩增出大 T 抗原 C-末端片段，则可按上述步骤 (1)～(3)重复试验 1 次，如仍未扩增出大 T 抗原 C_末端片段，则可判定为未检出 SV40 核酸序列。 页码数： 2005 版药典附录第 24 页 附录 V 除另有规定外，水溶液的 pH 值应以玻璃电极为指示电极、饱和甘汞电极为 参比电极的酸度计进行测定。酸度计应定期进行计量检定，并符合国家有关规 定。测定前，应采用下列标准缓冲液校正仪器，也可用国家标准物质管理部门 发放的标示 pH 值准确至 0．01pH 单位的各种标准缓冲液校正仪器。 1．仪器校正用的标准缓冲液