合规定。 凡规定进行无菌检查的鼻用制剂可不进行微乍物限度检查 【无菌】凡标签注明为无菌者,照无菌检查法(附录ⅫA)检查,应符合规定 书页号:2005版药典三部附录76页 附录ⅫC病毒外源因子 检查法 病毒类制品在毒种选育和生产过程中,经常使用动物或细胞基质培养,因 此,有可能造成外源因子(特别是外源病毒因子)的污染。为了保证制品质量,需 要对毒种和细胞进行外源因子的检测 病毒种子批外源因子检查 对病毒主种子批或工作种子批,应抽取足够检测试验需要量的供试品进行 病毒外源因子检测。在试验前应用非人源和非猴源(特殊情况除外)的特异性抗体 中和本病毒。制备抗血清(或单克隆抗体)所用的免疫原应采用与生产疫苗(或制 品)不同种而且无外源因子污染的细胞(或动物)制备。如果病毒曾在禽类组织或细 胞中繁殖过,则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚,应来自SPF鸡群。 1.动物试验法 (1)小鼠试验法取15~2g小鼠至少10只,用经抗血清中和后的病毒悬 液,每 只脑内接种003ml,同时腹腔接种0.5m。至少观察21天。在观察期内至少有80%最 初接种的小鼠存活,试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染,为符合要求 解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的小鼠,直接肉眼观察其病理改变, 并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少5只15~20g小鼠,并 观察21天,如果没有小鼠出现病毒感染,则符合要求。 (2)乳鼠试验法取出生后24小时内的乳鼠至少10只,用经抗血清中和 后的病 毒悬液,脑内接种0.0lml,同时腹腔接种至少0.lml。每天观察,至少14天。在观察 期内至少有80%最初接种的乳鼠存活,试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染 为符合要求。解剖所有在试验24小时后死亡或有患病体征的乳鼠,直接肉眼观察 其病理改变,并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接 种另外至少5只出生后24小时内的乳鼠,并每天观察至接种后第14天,如果没有 乳鼠出现病毒感染,则符合要求 2.细胞培养法 (1)非血吸附病毒检查用经抗血清中和后的病毒悬液,分别接种于人源、 猴 源和生产用的同种细胞。用人二倍体细胞生产的,还应接种另外一株人二倍体 细胞。每种细胞至少接种6瓶,每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的25%。 于36℃±1℃培养,观察14天,必要时可更换细胞培养液,未见细胞病变为阴性, 符合要求 (2)血吸附病毒检査上述接种病毒的各种细胞于第6~8天和第14天, 每种细 胞各取出2瓶进行血吸附病毒检査。用0.2%~0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于
合规定。 凡规定进行无菌检查的鼻用制剂可不进行微乍物限度检查。 【无菌】 凡标签注明为无菌者，照无菌检查法(附录ⅫA)检查，应符合规定。 书页号：2005 版药典三部附录 76 页 附录Ⅻ C 病毒外源因子 检查法 病毒类制品在毒种选育和生产过程中，经常使用动物或细胞基质培养，因 此，有可能造成外源因子(特别是外源病毒因子)的污染。为了保证制品质量，需 要对毒种和细胞进行外源因子的检测。 病毒种子批外源因子检查 对病毒主种子批或工作种子批，应抽取足够检测试验需要量的供试品进行 病毒外源因子检测。在试验前应用非人源和非猴源(特殊情况除外)的特异性抗体 中和本病毒。制备抗血清(或单克隆抗体)所用的免疫原应采用与生产疫苗(或制 品)不同种而且无外源因子污染的细胞(或动物)制备。如果病毒曾在禽类组织或细 胞中繁殖过，则抗体不能用禽类来制备。若用鸡胚，应来自 SPF 鸡群。 1．动物试验法 (1) 小鼠试验法 取 15～20g 小鼠至少 10 只，用经抗血清中和后的病毒悬 液，每 只脑内接种 0.03ml，同时腹腔接种 0.5ml。至少观察 21 天。在观察期内至少有 80%最 初接种的小鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染，为符合要求。 解剖所有在试验 24 小时后死亡或有患病体征的小鼠，直接肉眼观察其病理改变， 并将有病变的相应的组织悬液通过脑内和腹腔接种另外至少 5 只 15～20g 小鼠，并 观察 21 天，如果没有小鼠出现病毒感染，则符合要求。 (2) 乳鼠试验法 取出生后 24 小时内的乳鼠至少 10 只，用经抗血清中和 后的病 毒悬液，脑内接种 0.01ml，同时腹腔接种至少 0.1ml。每天观察，至少 14 天。在观察 期内至少有 80%最初接种的乳鼠存活，试验才有效。如果没有小鼠出现病毒感染， 为符合要求。解剖所有在试验 24 小时后死亡或有患病体征的乳鼠，直接肉眼观察 其病理改变，并取有病变的相应的组织和脑、脾制备成悬液通过脑内和腹腔接 种另外至少 5 只出生后 24 小时内的乳鼠，并每天观察至接种后第 14 天，如果没有 乳鼠出现病毒感染，则符合要求。 2．细胞培养法 (1) 非血吸附病毒检查 用经抗血清中和后的病毒悬液，分别接种于人源、 猴 源和生产用的同种细胞。用人二倍体细胞生产的，还应接种另外一株人二倍体 细胞。每种细胞至少接种 6 瓶，每瓶病毒悬液接种量不少于培养液总量的 25%。 于 36℃±1℃培养，观察 14 天，必要时可更换细胞培养液，未见细胞病变为阴性， 符合要求。 (2) 血吸附病毒检查 上述接种病毒的各种细胞于第 6～8 天和第 14 天， 每种细 胞各取出 2 瓶进行血吸附病毒检查。用 0.2%～0.5%鸡和豚鼠红细胞混合悬液覆盖于
细胞表面,置2~8℃30分钟,然后置20~25℃30分钟,分别进行镜检,观察红细 胞吸附情况,结果应均为阴性 3.鸡胚检查法 在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选 用9~11日和5~7日龄两组SPF鸡胚,每组至少5只,分别于尿囊腔和卵黄囊接种经 抗血清中和后的病毒悬液,每胚0.5ml。孵育7日后,取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞 混合悬液做血球凝集试验,应为阴性。被接种的鸡胚至少80%存活7天,试验有 效 生产用细胞外源因子检查 1.非血吸附病毒检查 (1)细胞直接观察每批生产用细胞应留取5%(或不少于500m)细胞悬液 不接种 病毒,作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液,置与疫苗生产相同的 条件下培养,观察14天,在显微镜下观察是否有细胞病变出现,无细胞病变出现 者为阴性,符合要求。在观察期末至少有80%的对照细胞培养物存活,试验有效 (2)细胞培养试验上述试验观察期末,收取上清液混合后,取适量接种 于猴 源和人源的细胞培养物,如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他细胞系上生产, 还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的25%。每种细胞至少检查 5ml上清混合液,置与生产相同的培养条件下培养。无细胞病变者为阴性,符合 要求 2.血吸附病毒检查 对上述细胞直接观察及细胞培养试验的细胞培养物在观察期末取至少25% 细胞培养瓶进行血吸附病毒检査(方法同病毒种子批外源因子检査的血吸附病毒 检查 页码数:2005版药典附录第20页 附录ⅣA醋酸纤维素薄膜 电泳法 试剂(1)巴比妥缓冲液(pH8.6)称取巴比妥2·76g、巴比妥钠15.45g, 加水溶 解使成1000m (2)氨基黑染色液称取氨基黑10BO.sg,溶于甲醇50ml、冰醋酸10m及水40ml 的 混合液中。附录ⅣCSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (3)漂洗液量取乙醇45mi、冰醋酸5ml及水50ml,混匀 4)透明液量取冰醋酸25m、无水乙醇75ml,混匀 测定法取醋酸纤维素薄膜,裁成2cmX8cm膜条,将无光泽面向下,浸入巴比 妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透,取出夹于滤纸中,轻轻吸去多余的缓冲液 后,将膜条无光泽面向上,置含巴比妥缓冲液(pH8.6)的电泳槽架上,通过滤 纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白含
细胞表面，置 2～8℃ 30 分钟，然后置 20～25℃ 30 分钟，分别进行镜检，观察红细 胞吸附情况，结果应均为阴性。 3．鸡胚检查法 在禽类组织或细胞中繁殖过的病毒种子需用鸡胚检查禽类病毒的污染。选 用 9～11 日和 5～7 日龄两组 SPF 鸡胚，每组至少 5 只，分别于尿囊腔和卵黄囊接种经 抗血清中和后的病毒悬液，每胚 0.5ml。孵育 7 日后，取尿囊液用豚鼠和鸡红细胞 混合悬液做血球凝集试验，应为阴性。被接种的鸡胚至少 80%存活 7 天，试验有 效。 生产用细胞外源因子检查 1．非血吸附病毒检查 (1) 细胞直接观察 每批生产用细胞应留取 5%(或不少于 500ml)细胞悬液 不接种 病毒，作为对照细胞加入与疫苗生产相同的细胞维持液，置与疫苗生产相同的 条件下培养，观察 14 天，在显微镜下观察是否有细胞病变出现，无细胞病变出现 者为阴性，符合要求。在观察期末至少有 80%的对照细胞培养物存活，试验有效。 (2) 细胞培养试验 上述试验观察期末，收取上清液混合后，取适量接种 于猴 源和人源的细胞培养物，如果疫苗病毒在非猴源或非人源其他细胞系上生产， 还应接种于同种不同批细胞。接种量应不少于总量的 25%。每种细胞至少检查 5ml 上清混合液，置与生产相同的培养条件下培养。无细胞病变者为阴性，符合 要求。 2．血吸附病毒检查 对上述细胞直接观察及细胞培养试验的细胞培养物在观察期末取至少 25% 的 细胞培养瓶进行血吸附病毒检查(方法同病毒种子批外源因子检查的血吸附病毒 检查)。 页码数： 2005 版药典附录第 20 页 附录ⅣA 醋酸纤维素薄膜 电泳法 试剂 (1)巴比妥缓冲液(pH8．6) 称取巴比妥 2·76g、巴比妥钠 15．45g， 加水溶 解使成 1000ml。 (2)氨基黑染色液称取氨基黑 10B O．5g，溶于甲醇 50ml、冰醋酸 10ml 及水 40ml 的 混合液中。附录ⅣC SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (3)漂洗液量取乙醇 45mi、冰醋酸 5ml 及水 50ml，混匀。 (4)透明液 量取冰醋酸 25ml、无水乙醇 75ml，混匀。 测定法取醋酸纤维素薄膜，裁成 2cmX 8cm 膜条，将无光泽面向下，浸入巴比 妥缓冲液(pH8．6)中，待完全浸透，取出夹于滤纸中，轻轻吸去多余的缓冲液 后，将膜条无光泽面向上，置含巴比妥缓冲液(pH8．6)的电泳槽架上，通过滤 纸桥浸入巴比妥缓冲液(pH8．6)中。于膜条上距负极端 2cm 处，条状滴加蛋白含
量约5%的供试品溶液2~3m,在O.4~O.6mA/cm[总电流量=电流量(mA/cm) 每条膜的宽度(cm)×膜条数电流条件下电泳:同时取新鲜人血清作对照,电泳时 间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离约2cm为宜。电泳完毕,将膜条 取下浸于氨基黑染色液中,2~3分钟后,用漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为 止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中,待全部浸透后,取出平铺于洁净 的玻板上,干燥后即成透明薄膜,可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的 醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在 记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图,以人血清作对照,按峰面积计算各蛋白 组分的含量(%)。 页码数:2005版药典附录第47页 附录ⅨC大肠杆菌菌体蛋白残留量测定法 本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体 蛋白含量 试剂(1)包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)称取碳酸钠O.32g、碳酸氢钠0.586g, 置200m量瓶中加水溶解并稀释至刻度。 (2)磷酸盐缓冲液(φpH7.4)称取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠l41、 磷 酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至500ml,121℃灭菌15分钟。 (3)洗涤液(pH7.4)取聚山梨酯200.5ml,加磷酸盐缓冲液至500ml (4)稀释液(pH7.4)称取牛血清白蛋白0.5g,加洗涤液溶解并稀释至100ml (5)浓稀释液称取牛血清白蛋白1.0g,加洗涤液溶解并稀释至100ml (6)底物缓冲液(pH5.0枸橼酸一磷酸盐缓冲液)称取磷酸氢二钠 (Na2HP04·12H20)1.84g、枸橼酸O.51g,加水溶解,并稀释至100ml (⑦)底物液取邻苯二胺8mg,30%过氧化氢30μ1,溶于底物缓冲液20ml中。(临 用 时现配。) (8)终止液lmol/L硫酸溶液标准品溶液的制备按菌体蛋白标准品说明书加水 复溶,精密量取适量,用稀释液稀释成每lm中含菌体蛋白50og、25ng、125ng、 62.5ng、31.25ng、15.625ng、7.8125ng的溶液。 供试品溶液的制备取供试品适量,用稀释液稀释成每lm中约含250μg的溶液。 如供试品每lml中含量小于500ug时,用浓稀释液稀释一倍 测定法取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量,用包被液溶解并稀释成每lm中含 10ug的溶液,以100ul/孔加至96孔酶标板内,4℃放置过夜(16~18小时)。用洗涤 液洗板3次:用洗涤液制备1%牛血清白蛋白溶液,以200μ1/孔加至板内,37℃放 置2小时:将封闭好的酶标板用洗涤液洗板3次:以100μ1/孔加入标准品溶液和 供试品溶液,每个稀释度做双孔,同时加入两孔空白对照(稀释液),37℃(3放置 2小时:用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体1000 倍,以100μ1孔加至板内,37℃放置1小时,用洗涤液洗板10次,以100μ1/孔加入 物液,37℃避光放置40分钟,以50μ1/孔加入终止液终止反应。用酶标仪在492nm 波长处测定吸光度,应用计算机分析软件进行读数和数据分析,也可使用手工
量约 5％的供试品溶液 2～3ffl，在 O．4～O．6mA／cm[总电流量=电流量(mA／cm)× 每条膜的宽度(cm)×膜条数]电流条件下电泳；同时取新鲜人血清作对照，电泳时 间以白蛋白与丙种球蛋白之间的电泳展开距离约 2cm 为宜。电泳完毕，将膜条 取下浸于氨基黑染色液中，2～3 分钟后，用漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为 止。将洗净并完全干燥的膜条浸于透明液中，待全部浸透后，取出平铺于洁净 的玻板上，干燥后即成透明薄膜，可供测定纯度和作标本长期保存。将干燥的 醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪采用反射(未透明薄膜)或透射(已透明薄膜)方式在 记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图，以人血清作对照，按峰面积计算各蛋白 组分的含量(％)。 页码数： 2005 版药典附录第 47 页 附录ⅨC 大肠杆菌菌体蛋白残留量测定法 本法系采用酶联免疫法测定大肠杆菌表达系统生产的重组制品中残留菌体 蛋白含量。 试剂 (1)包被液(pH9．6 碳酸盐缓冲液) 称取碳酸钠 O．32g、碳酸氢钠 0．586g， 置 200ml 量瓶中加水溶解并稀释至刻度。 (2)磷酸盐缓冲液(pH 7．4) 称取氯化钠 8g、氯化钾 0．2g、磷酸氢二钠 l.44g、 磷 酸二氢钾 0．24g，加水溶解并稀释至 500ml，121℃灭菌 15 分钟。 (3)洗涤液(pH 7．4) 取聚山梨酯 20 0．5ml，加磷酸盐缓冲液至 500ml。 (4)稀释液(pH 7．4) 称取牛血清白蛋白 0．5g，加洗涤液溶解并稀释至 100ml。 (5)浓稀释液称取牛血清白蛋白 1．0g，加洗涤液溶解并稀释至 100ml。 (6)底物缓冲液(pH5．0 枸橼酸一磷酸盐缓冲液) 称取磷酸氢二钠 (Na2 HP04·12H20)1．84g、枸橼酸 O．51g，加水溶解，并稀释至 100ml。 (7)底物液取邻苯二胺 8mg，30％过氧化氢 30μ1，溶于底物缓冲液 20ml 中。(临 用 时现配。) (8)终止液 1mol／L 硫酸溶液标准品溶液的制备按菌体蛋白标准品说明书加水 复溶，精密量取适量，用稀释液稀释成每 lml 中含菌体蛋白 500ng、250ng、125ng、 62．5ng、31．25ng、15．625ng、7．8125ng 的溶液。 供试品溶液的制备取供试品适量，用稀释液稀释成每 lml 中约含 250μg 的溶液。 如供试品每 lml 中含量小于 500μg 时，用浓稀释液稀释一倍。 测定法取兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体适量，用包被液溶解并稀释成每 lml 中含 10μg 的溶液，以 100μl／孔加至 96 孔酶标板内，4℃放置过夜(16～18 小时)。用洗涤 液洗板 3 次；用洗涤液制备 1％牛血清白蛋白溶液，以 200μl／孔加至板内，37℃放 置 2 小时；将封闭好的酶标板用洗涤液洗板 3 次；以 100μ1／孔加入标准品溶液和 供试品溶液，每个稀释度做双孔，同时加入两孔空白对照(稀释液)，37℃(3 放置 2 小时；用稀释液稀释辣根过氧化酶(HRP)标记的兔抗大肠杆菌菌体蛋白抗体 1000 倍，以 100μl 孔加至板内，37℃放置 1 小时，用洗涤液洗板 10 次，以 100μl／孔加入 底 物液，37℃避光放置 40 分钟，以 50μ1／孔加入终止液终止反应。用酶标仪在 492nm 波长处测定吸光度，应用计算机分析软件进行读数和数据分析，也可使用手工
作图法计算。 以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线,并以供试品溶液吸光度在 标准曲线上得到相应菌体蛋白含量,按以下公式计算 供试品菌体蛋白残留含量(%)=c*D*100%/T*100000 式中c为供试品溶液中菌体蛋白质含量,ng/ml; D为供试品稀释倍数 T为供试品蛋白质含量,mg/ml 页码数:2005版药典附录第29页 附录 ⅥA氮测定法 (半微量法) 本法系依据含氮有机物经硫酸消化后,生成硫酸铵,硫酸铵被氢氧化钠分 解释放出氨,后者借水蒸气被蒸馏人硼酸液中生成硼酸铵,最后用强酸滴定, 依据强酸消耗量可计算出供试品的氮含量。 试剂(1)消化剂称取硫酸铜(CuS04·5H20)l0g、硫酸钾IOOg,置乳钵内,共 同研 细,混匀 (2)混合指示液0.2%溴甲酚绿乙醇溶液5份与O.1%甲基红乙醇溶液2份混 配成。 (3)2%硼酸吸收液称取硼酸20g,加水溶解并稀释成100mnl,加混合指示液 10ml, 混匀。 (4)硫酸滴定液(O.05mol/L)取硫酸3m,缓缓注入适量水中,冷却至室温, 加水稀释至1000m,摇匀。 取在270~300℃千燥至恒重的基准无水碳酸钠约O.15g,精密称定,加水50ml 使溶解,加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂10滴,用本液滴定至溶液由绿色转变为 紫红色时,煮沸2分钟,冷却至室温,继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每 lml硫酸滴定液(O.05o0/L)相当于5.30mg的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与 无水碳酸钠的取用量,算出本液的浓度,即得。 (5)硫酸滴定液(0.005to0/)的配制精密量取硫酸滴定液(0.05tol/ L)IOOml, 置于1000ml量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀。 测定法精密量取一定体积的供试品(约相当于含氮量1.0~2.Omg),置凯氏 定氮瓶中,加消化剂约0.3g,硫酸lm消化至澄明,呈蓝绿色,继续消化约60分 取2%硼酸吸收液lon置loon锥形瓶内,将凯氏蒸馏器冷凝管末端浸入硼 酸 吸收液内,将消化好的供试品移入凯氏蒸馏器内,用水洗定氮瓶3~4次,将洗
作图法计算。 以标准品溶液吸光度对相应的浓度作标准曲线，并以供试品溶液吸光度在 标准曲线上得到相应菌体蛋白含量，按以下公式计算 供试品菌体蛋白残留含量(％)= c*D*100%/T*1000000 式中 c 为供试品溶液中菌体蛋白质含量，ng／ml； D 为供试品稀释倍数； T 为供试品蛋白质含量，mg／ml。 页码数： 2005 版药典附录第 29 页 附录 ⅥA 氮测定法 (半微量法) 本法系依据含氮有机物经硫酸消化后，生成硫酸铵，硫酸铵被氢氧化钠分 解释放出氨，后者借水蒸气被蒸馏人硼酸液中生成硼酸铵，最后用强酸滴定， 依据强酸消耗量可计算出供试品的氮含量。 试剂(1)消化剂 称取硫酸铜(CuS04·5H20)10g、硫酸钾 lOOg，置乳钵内，共 同研 细，混匀。 (2)混合指示液 0．2％溴甲酚绿乙醇溶液 5 份与 O．1％甲基红乙醇溶液 2 份混 合 配成。 (3)2％硼酸吸收液称取硼酸 20g，加水溶解并稀释成 1000ml，加混合指示液 10ml， 混匀。 (4)硫酸滴定液(O．05mol／L) 取硫酸 3ml，缓缓注入适量水中，冷却至室温， 加水稀释至 1000ml，摇匀。 取在 270～300℃干燥至恒重的基准无水碳酸钠约 O．15g，精密称定，加水 50ml 使溶解，加甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 10 滴，用本液滴定至溶液由绿色转变为 紫红色时，煮沸 2 分钟，冷却至室温，继续滴定至溶液由绿色变为暗紫色。每 lml 硫酸滴定液(O．05tool／L)相当于 5．30mg 的无水碳酸钠。根据本液的消耗量与 无水碳酸钠的取用量，算出本液的浓度，即得。 (5)硫酸滴定液(0．005tool／L)的配制 精密量取硫酸滴定液(0．05 tool／ L)lOOml， 置于 1000ml 量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。 测定法精密量取一定体积的供试品(约相当于含氮量 1．0～2．Omg)，置凯氏 定氮瓶中，加消化剂约 0．3g，硫酸 lml 消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化约 60 分 钟。 取 2％硼酸吸收液 10ml 置 lOOml 锥形瓶内，将凯氏蒸馏器冷凝管末端浸入硼 酸 吸收液内，将消化好的供试品移入凯氏蒸馏器内，用水洗定氮瓶 3～4 次，将洗
液移入蒸馏器内,再加入50%氢氧化钠溶液5m,然后进行蒸馏,待接收液总体 积约35~50ml,将冷凝管末端移出液面,使蒸汽继续冲洗约1分钟,用水淋洗尖 端后停止蒸馏。接收液用硫酸滴定液(O.005mol/L)进行滴定,至溶液由蓝绿色 变为灰紫色,并将滴定的结果用空白试验校正。 按下式计算 氮含量(mg/m)=(VxVo)*c*14.01°n*2/ 式中x为供试品消耗酸滴定液的体积,ml Vo为空白消耗酸滴定液的体积,ml c为硫酸滴定液的浓度,mol/L: n为供试品的稀释倍数; V为供试品溶液的体积,ml 14.Ol为氮的相对原子质量 【附注】(1)蒸馏前应蒸洗蒸馏器15分钟以上 (2)蒸汽发生瓶内应加数滴硫酸及甲基红指示剂至呈明显红色 (3)也可用全自动凯氏定氮仪测定 页码数:2005版药典附录第29页 附录ⅥB蛋白质 测定法 第一法凯氏定氮法 本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液 中的非蛋白氮含量,计算出蛋白质的含量 供试品溶液的制备(1)总氮测定溶液的制备精密量取供试品Im,用生理氯化 钠溶液准确稀释至每lml含氮量约lmg。 液Zm;(2)非蛋白氮测定溶液的制备精密量取供试品2ml,加水14ml、10%钨酸钠溶 硫酸溶液(1.86-100)2m,摇匀,静置30分钟过滤,取滤液测定, 测定法精密量取总氮测定溶液lml,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(附录ⅥA) 测定供试品中总氮含量。同时做空白对照。 精密量取非蛋白氮测定溶液5ml,置凯氏定氮瓶中,照氮测定法(附录ⅥA)测 定供试品中非蛋白氮含量。 按下式计算 CTN(mg/m1)=(Vx1Vo)*C*14.01*n*2/1 CNPN(mg/m1)=(Vx2-Vo)*c*14. 01*n*2/v2 CPN(mg/ml)=CTN-CNPN 供试品蛋白质含量(%,g/ml)=CPN*6.25*100/1000 式中CIN为供试品溶液总氮含量,mg/m CNPN为供试品溶液非蛋白氮含量,mg/ml; Vx为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积,m; Vx2为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积,ml V0为空白试验消耗酸滴定液的体积,ml c为硫酸滴定液的浓度,mol/L CPN为供试品蛋白氮含量,mg/ml
液移入蒸馏器内，再加入 50％氢氧化钠溶液 5ml，然后进行蒸馏，待接收液总体 积约 35～50ml，将冷凝管末端移出液面，使蒸汽继续冲洗约 1 分钟，用水淋洗尖 端后停止蒸馏。接收液用硫酸滴定液(O．005mol／L)进行滴定，至溶液由蓝绿色 变为灰紫色，并将滴定的结果用空白试验校正。 按下式计算 氮含量(mg／m1)=(Vx-Vo)*c*14．01*n*2/V 式中 Vx 为供试品消耗酸滴定液的体积，ml； V0 为空白消耗酸滴定液的体积，ml； c 为硫酸滴定液的浓度，mol／L； n 为供试品的稀释倍数； V 为供试品溶液的体积，ml； 14．Ol 为氮的相对原子质量。 【附注】 (1)蒸馏前应蒸洗蒸馏器 15 分钟以上。 (2)蒸汽发生瓶内应加数滴硫酸及甲基红指示剂至呈明显红色。 (3)也可用全自动凯氏定氮仪测定。 页码数： 2005 版药典附录第 29 页 附录ⅥB 蛋白质 测定法 第一法凯氏定氮法 本法系通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液 中的非蛋白氮含量，计算出蛋白质的含量。 供试品溶液的制备 (1)总氮测定溶液的制备精密量取供试品 lml，用生理氯化 钠溶液准确稀释至每 lml 含氮量约 lmg。 (2)非蛋白氮测定溶液的制备 精密量取供试品 2ml，加水 14ml、10％钨酸钠溶 液 2ml、硫酸溶液(1．86-100)2ml，摇匀，静置 30 分钟过滤，取滤液测定。 测定法精密量取总氮测定溶液 lml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(附录ⅥA) 测定供试品中总氮含量。同时做空白对照。 精密量取非蛋白氮测定溶液 5ml，置凯氏定氮瓶中，照氮测定法(附录ⅥA)测 定供试品中非蛋白氮含量。 按下式计算 CTN(mg／m1)=(Vx1-Vo)*C*14．01*n*2/v1 CNPN(mg／m1)=(Vx2-Vo)*c*14．01*n*2/v2 CPN(mg/ml)=CTN-CNPN 供试品蛋白质含量(％，g／m1)=CPN*6．25*100/1000 式中 CTN 为供试品溶液总氮含量，mg／ml； CNPN 为供试品溶液非蛋白氮含量，mg／ml； Vxl 为供试品总氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml； Vx2 为供试品非蛋白氮测定溶液消耗酸滴定液的体积，ml； V0 为空白试验消耗酸滴定液的体积，ml； c 为硫酸滴定液的浓度，mol／L； CPN 为供试品蛋白氮含量，mg／ml；