第九章免疫检测(监测)一、定义：利用免疫学的测定方法对动物的免疫功能和某些疾病进行测定和诊断。又称免疫学诊断。二、应用1.用已知的抗原测定未知抗体或致敏LC1）活畜的检疫（主要是结核），主要用于传染病2）免疫水平的测定3）疫苗的效果考核4）血清流行病学调查5）快速诊断2.用已知的抗体测未知抗原1）传染病的诊断2）病原的鉴定3）抗原的提纯4）抗原定位检查5）动物体生物活性物质测定，包括激素，微量药物，在兽医上主要用母畜的早期妊娠诊断等3.免疫功能的测定1）体液免疫：BC抗体水平2）细胞免疫：TC，K，NK，巨噬C三、分类体液体外监测、细胞体液体内监测+细胞四、免疫检测方法的要求1.特异性强：尽量减少交叉反应2.灵敏度高：微量抗原，抗体3.操作要简便：不需特殊设备，易于推广4.阴性和阳性对照（特异性高，准确性高，但灵敏度低，灵敏度高，但需特殊设备则不能同时满足三条件）
第九章 免疫检测(监测) 一、定义：利用免疫学的测定方法对动物的免疫功能和某些疾病进行测定和 诊断。又称免疫学诊断。 二、应用 1．用已知的抗原测定未知抗体或致敏 LC 1) 活畜的检疫(主要是结核)，主要用于传染病 2) 免疫水平的测定 3) 疫苗的效果考核 4) 血清流行病学调查 5) 快速诊断 2．用已知的抗体测未知抗原 1) 传染病的诊断 2) 病原的鉴定 3) 抗原的提纯 4) 抗原定位检查 5) 动物体生物活性物质测定，包括激素，微量药物，在兽医上主要用母畜 的早期妊娠诊断等 3．免疫功能的测定 1) 体液免疫：BC 抗体水平 2) 细胞免疫：TC，K，NK，巨噬 C 三、分类 体液 体外监测 细胞 体液 体内监测 细胞 四、免疫检测方法的要求 1． 特异性强：尽量减少交叉反应 2． 灵敏度高：微量抗原，抗体 3． 操作要简便：不需特殊设备，易于推广 4． 阴性和阳性对照 （特异性高，准确性高，但灵敏度低，灵敏度高，但需特殊设备则不能同时 满足三条件）
第一节体外体液测定方法一血清学试验技术（新书第24章）1.．血清学反应：以血清中抗体为被测定对象或诊断试剂而进行的体外的体液的抗原抗体反应抗原与抗体的结合力：抗原与抗体结合是通过以下形式结合的（1）静电力作用：由抗原与抗体上带的阳性电荷和阴性电荷互相吸引面结合(1)氢键结合作用：由Ag和Ab分子上的亲水基因互相结合(2）疏水相互作用：当抗原抗体分表面的疏水基因互相吸引而发生结合(3）范德华力：由Ab和Ag分子外层电之间的吸引而发生结合2.抗原抗体结合特征1）高度特异性与可可逆性(Ab和Ag可特异性结合，但也以发生离解，即结合后不久可脱离因此与在观察结果时要一定时内完成否则造成不足现象而出现阴性结果）2）最适比与带现象最适比：当抗原抗体比例适当才可见的现象带现象：抗原或抗体不足（Ab和Ag两者只有在比例适当时才出现可见反应，否则未结合的抗体或抗原游离于上清液中，不能形成大块复合物，因而不出现可见反应，这种现象称为带现象。抗体过剩一前带现象，抗原过剩一后带现象3）反应的阶段性可分为两个阶段，第一阶段为Ab和Ag的特异性结合阶段，反应快，但不出现肉眼可见现象。第二阶段称为Ab和Ag的可见阶段，当Ab和Ag结合后在电介质，温度，PH，补体等影响下，发生肉眼可见凝集，沉淀，溶解，吸收，补体结合等反应，主要反应较慢，需几分钟甚至几十分钟或更久。3.影响抗原抗体反应的因素1)温度，一般37度2)PH值中性6.4~7.63)电解质液：大多数AgAb反应都需一定浓度电解液（等渗液），生理盐水，PBS4)振荡与混合4.血清学试验中抗原，抗体浓度（含量）的表示方法效价（毒价、凝集价，中和价）都指出现明显反应终点的抗原或血清的最高的稀释倍数
第一节 体外体液测定方法——血清学试验技术（新书第 24 章） 1． 血清学反应：以血清中抗体为被测定对象或诊断试剂而进行的体外 的体液的抗原抗体反应 抗原与抗体的结合力：抗原与抗体结合是通过以下形式结合的 (1)静电力作用：由抗原与抗体上带的阳性电荷和阴性电荷互相吸引面结合 (1) 氢键结合作用：由 Ag 和 Ab 分子上的亲水基因互相结合 (2) 疏水相互作用：当抗原抗体分表面的疏水基因互相吸引而发生结合 (3) 范德华力：由 Ab 和 Ag 分子外层电之间的吸引而发生结合 2． 抗原抗体结合特征 1） 高度特异性与可可逆性(Ab 和 Ag 可特异性结合，但也以发生离解， 即结合后不久可脱离因此与在观察结果时要一定时内完成否则造成不足现象而 出现阴性结果) 2） 最适比与带现象 最适比：当抗原抗体比例适当才可见的现象 带现象：抗原或抗体不足（Ab 和 Ag 两者只有在比例适当时才出现可见反 应，否则未结合的抗体或抗原游离于上清液中，不能形成大块复合物，因而不出 现可见反应，这种现象称为带现象。 抗体过剩——前带现象，抗原过剩——后带现象 3） 反应的阶段性 可分为两个阶段，第一阶段为 Ab 和 Ag 的特异性结合阶段，反应快，但不 出现肉眼可见现象。第二阶段称为 Ab 和 Ag 的可见阶段，当 Ab 和 Ag 结合后在 电介质，温度，PH，补体等影响下，发生肉眼可见凝集，沉淀，溶解，吸收， 补体结合等反应，主要反应较慢，需几分钟甚至几十分钟或更久。 3． 影响抗原抗体反应的因素 1） 温度，一般 37 度 2） PH 值 中性 6.4~7.6 3） 电解质液：大多数 Ag Ab 反应都需一定浓度电解液（等渗液），生理 盐水，PBS 4） 振荡与混合 4． 血清学试验中抗原，抗体浓度（含量）的表示方法 效价（毒价、凝集价，中和价）都指出现明显反应终点的抗原或血清的最高 的稀释倍数
（一）凝集反应颗粒性抗原与相应的抗体结合在适量电解质存在下，经过一定时间出现肉眼可见的凝集块，这种反应叫～凝集：抗原一凝集原，抗体凝集素颗粒性抗原：大分子抗原，病毒颗粒，原虫虫体1.直接凝集反应颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现可见反应1）平板凝集反应：抗原或抗体的定性（1）已知抗原查未知抗体大群检疫，布病，鸡白痢，鸡霉形体感染（2）已知抗体测未知的细菌优点：操作简便用于大群检疫灵敏度不高，检出率低2）试管凝集反应：抗体的定性和定量（效价）抗原与抗体在含有电解质液的试管中的反应（如兽医上常用布氏杆菌试管凝集反应，是布病检疫的常用方法。间接凝集反应2.将不溶性抗原先吸附在一种与免疫无关的大分子物体上（载体）就变为颗粒性Ag后与相应Ab结合出现可见的凝集块。（这种反应由于使分散的抗原吸附在载体颗粒上，将沉淀反应转化为凝集反应，当载体颗粒上的抗原与微量抗体结合后，就足出现肉眼可见的反应，提高了反应的敏感性。常用载体：红C（绵羊红细胞，人O型），聚苯乙烯乳胶，活性碳分别称之为：间接血凝，乳胶凝集试验，碳素凝集试验1）正向间接凝集反应（即间接凝集反应）已知Ag吸附在载体表面，测定未知抗体（1）间接血凝试验（HA)：可溶性Ag+红C—颗粒性Ag+Ab用绵羊红细胞作为载体，吸时可溶性抗原形成致敏红细胞。一般多糖抗原可直接吸吋于红细胞表面，而蛋白质抗原则需借助于化学媒介物偶联于红细胞上，常用方法有酸处理法，戊二醛法等方法：红细胞（甲醛，成二醛，醛化）酸化+可溶性Ag（敏化）诊断抗原血球（敏化血球）+Ab一血凝反应特点：操作简便敏感性特异性高主要用于某些传染病和寄生虫病的诊断（猪瘟，羊衣原体，弓形体，锥虫病羊多头蝴，棘球，旋毛虫）（2）乳胶凝集试验
（一） 凝集反应 颗粒性抗原与相应的抗体结合在适量电解质存在下，经过一定时间出现肉眼 可见的凝集块，这种反应叫~ 凝集：抗原——凝集原，抗体——凝集素 颗粒性抗原：大分子抗原，病毒颗粒，原虫虫体 1． 直接凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体直接结合出现可见反应 1） 平板凝集反应：抗原或抗体的定性 （1）已知抗原查未知抗体大群检疫，布病，鸡白痢，鸡霉形体感染（2）已知抗 体测未知的细菌 优点：操作简便用于大群检疫 灵敏度不高，检出率低 2） 试管凝集反应：抗体的定性和定量（效价） 抗原与抗体在含有电解质液的试管中的反应(如兽医上常用布氏杆菌试管凝 集反应，是布病检疫的常用方法。 2． 间接凝集反应 将不溶性抗原先吸附在一种与免疫无关的大分子物体上（载体）就变为颗 粒性 Ag 后与相应 Ab 结合出现可见的凝集块。(这种反应由于使分散的抗原吸附 在载体颗粒上，将沉淀反应转化为凝集反应，当载体颗粒上的抗原与微量抗体结 合后，就足出现肉眼可见的反应，提高了反应的敏感性。 常用载体：红 C（绵羊红细胞，人 O 型），聚苯乙烯乳胶，活性碳 分别称之为：间接血凝，乳胶凝集试验，碳素凝集试验 1） 正向间接凝集反应（即间接凝集反应） 已知 Ag 吸附在载体表面，测定未知抗体 （1） 间接血凝试验（HA）：可溶性 Ag+红 C——颗粒性 Ag+Ab 用绵羊红细胞作为载体，吸咐可溶性抗原形成致敏红细胞。一般多糖抗原可 直接吸咐于红细胞表面，而蛋白质抗原则需借助于化学媒介物偶联于红细胞上， 常用方法有鞣酸处理法，戊二醛法等 方法：红细胞（甲醛，成二醛，醛化）鞣酸鞣化+可溶性 Ag（敏化） 诊断抗原血球（敏化血球）+Ab——血凝反应 特点：操作简便敏感性特异性高 主要用于某些传染病和寄生虫病的诊断（猪瘟，羊衣原体，弓形体，锥虫病， 羊多头蚴，棘球蚴，旋毛虫） （2） 乳胶凝集试验
可溶性Ag+乳胶——颗粒性Ag+Ab2）反向间接凝集反应可溶性Ab+载体——颗粒性Ab+Ag测某些小分子可溶性Ag，人主要测乙肝Ag3）协同凝集反应抗体+SPA一诊断用SPAAB+未知细菌一凝集反应用于未知菌的鉴定原理：金黄色葡萄球菌细胞壁上的A蛋白(SPA)，具有和大多数哺乳动物IgG的Fc段发生非特异性结合特性，而IgG的Fab段则与特异性抗原结合，当标记的SPA上的IgG与抗原相见时，则IgG，Fab段与抗原结合，从而起到协同凝集作用，它的特点是即保持SPA标记抗体的方法，对应提高抗体的敏感性。含A蛋白的金黄色葡萄球菌在反应中起到载体和“放大的作用。血凝与血凝抑制反应（HA—HI试验）原理：微生物可凝集某些动物的红C出现HA反应，当加入相应抗体时就出现不凝集（HI抑制微生物对红C的凝集）现象（某些微生物能凝集哺乳动物和禽类的红细胞而针对这种微生物的抗体能抑制近种血凝反应，前者称血凝反应，后者称血凝抑制反应）应用：（1）用已知AB测未知病毒，诊断传染病ND（2）用已知病毒测血清中AB含量，监测动物免疫水平及早期诊断方法：常用B——微量法，——固定病毒稀释血清法(另少用固定血清稀释)步骤：（1）先测定病毒的HA效价：稀释病毒十红C一一血凝（2）（以NDV为例）用已知4单位的病毒十稀释血清十红C一一有无凝集体（以完全抑制V血凝反应的血清最高稀释度的倒数来表示抗体的HI效价，如1：256，Log8)注意问题：1)作HI试验时（包括间接血凝试验）一定掌握判定时间和温度，一般以室温20~30分钟，4度《1小时，温度过高或判定时间过长，可能使凝集的红细胞发生洗脱而沉淀下来，出现假阳性（HI）和假阴性（IHA）试验结果。3）某些血清中可能存在非特异性血凝抑制物或天然血凝素，而出现非特异性结果（HI）因此试验时必须设对照，包括（1）阳性对照V+抗体+血球（2）阴性对照，V+生理盐水+血球（3）血球对照，生理盐水+血球。必要时可用红细胞吸收血清中的非特异性凝集素，或用胰旦白酶除去非特异性抑制物。（主要用于ND的诊断）（二）沉淀反应(precipitation）可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量的电解质中，形成肉眼可见的沉淀物（由于该反应的抗原常比抗体分子小，因而在单位体中所含分子数目抗体多，故实验时为了避免抗原过多，常稀释抗原，实验结果也多以抗原的稀释度大小作为沉淀反应的效价）沉淀原参与沉淀反应的抗原沉淀素—AB1：液体内沉淀试验：液相沉淀反应（1）环状沉淀反应小试管中进行：AB试管一AG—两界出现白色沉淀环—阳性
可溶性 Ag+乳胶——颗粒性 Ag+Ab 2） 反向间接凝集反应 可溶性 Ab+载体——颗粒性 Ab+Ag 测某些小分子可溶性 Ag，人主要测乙肝 Ag 3） 协同凝集反应 抗体+SPA——诊断用 SPAAB+未知细菌——凝集反应用于未知菌的鉴定 原理：金黄色葡萄球菌细胞壁上的 A 蛋白(SPA)，具有和大多数哺乳动物 IgG 的 Fc 段发生非特异性结合特性，而 IgG 的 Fab 段则与特异性抗原结合，当标记 的 SPA 上的 IgG 与抗原相见时，则 IgG，Fab 段与抗原结合，从而起到协同凝集 作用，它的特点是即保持了 SPA 标记抗体的方法，对应提高了抗体的敏感性。 含 A 蛋白的金黄色葡萄球菌在反应中起到载体和“放大”的作用。 血凝与血凝抑制反应（HA——HI 试验） 原理：微生物可凝集某些动物的红 C 出现 HA 反应，当加入相应抗体时就出现不凝集 （ＨＩ抑制微生物对红Ｃ的凝集）现象(某些微生物能凝集哺 乳动物 和禽类的红细胞而针 对这种微生物的抗体能抑制近种血凝 反应，前 者称血凝反应，后者称血凝抑制反应) 应用：（１）用已知ＡＢ测未知病毒，诊断传染病 ＮＤ （２）用已知病毒测血清中ＡＢ含量，监测动物免疫水平及早期诊断 方法：常用Ｂ——微量法，——固定病毒稀释血清法(另少用固定血清稀释) 步骤：（１）先测定病毒的ＨＡ效价：稀释病毒＋红Ｃ——血凝 （２）（以ＮＤＶ为例）用已知４单位的病毒＋稀释血清＋红Ｃ——有无凝集体(以完全 抑制 V 血凝反应的血清最高稀释度的倒数来表示抗体的 HI 效价，如 1：256，Log8) 注意问题：1)作 HI 试验时(包括间接血凝试验)一定掌握判定时间和温度，一般以室温 20~30 分钟，4 度《1 小时 ，温度过高或判定时间过长，可能使凝集的红细胞发生冼脱而沉 淀下来，出现假阳性（HI）和假阴性（IHA）试验结果。 3） 某些血清中可能存在非特异性血凝抑制物或天然血凝素，而出现非特异性结果 （HI）因此试验时必须设对照，包括（1）阳性对照 V+抗体+血球（2）阴性对照，V+生理 盐水+血球（3）血球对照，生理盐水+血球。 必要时可用红细胞吸收血清中的非特异性凝集素，或用胰旦白酶除去非特异性抑制物。 （主要用于 ND 的诊断） （二） 沉淀反应(precipitation ) 可溶性抗原与相应抗体结合后，在适量的电解质中，形成肉眼可见的沉淀 物（由于该反应的抗原常比抗体分子小，因而在单位体中所含分子数目抗体多， 故实验时为了避免抗原过多，常稀释抗原，实验结果也多以抗原的稀释度大小作 为沉淀反应的效价） 沉淀原——参与沉淀反应的抗原 沉淀素——ＡＢ １． 液体内沉淀试验：液相沉淀反应 （1）环状沉淀反应 小试管中进行：ＡＢ——试管——ＡＧ——两界出现白色沉淀环——阳性
用途1）兽医上主要用于炭疽Ag的测定。将这种用于测定炭疽抗原的环状沉淀反应叫Ascolis反应2）法医上血迹的鉴定3）昆虫学：天敌的调查（2）絮状沉淀反应：抗原与抗体在试管或玻片上混合，如出现絮状沉淀即为阳性反应，常用于人医诊断梅素的康氏试验。2。凝胶内沉淀反应：固相沉淀反应（1）琼脂扩散试验将Ag，Ab分别加于到1%以下琼脂的半固体中，当Ag，Ab相遇且比例适当时就会形成一条白色沉淀线。1）单向单扩散主要用Ag或Ab的成分和定量分析。（1）测Ag时，抗体十琼脂——制板——分别打孔加入稀释后的抗原-根据沉淀环的大小测Ag的含量（2）测Ab时反之（将抗体混合琼脂中制成平板，打孔，然后将抗原加入孔中，环的直径与抗原浓度成正比）2）单向双扩散，少用。3）双向单扩散，马立克病的诊断。Ab浇板，打孔，孔中加Ag，测定Ag浓度。4）双向双扩散（琼扩，AGP）分别将Ag，AB加入琼脂板的小孔内，双向扩散，两相相遇时出现沉淀线，依沉淀线的有无和出现的距离判断Ag（Ab）的含量（沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性，且与浓度，分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体浓度相等，分子大小相近，则沉淀线位于两孔之中呈直线状，当抗原浓度比抗体高时，沉淀线靠近抗体一端并增厚反之亦然。兽医上应用最广的血清学试验，古老但准确性高，操作简便缺点：灵敏度低，检出率低应用：定性测定未知Ag或Ab。分析鉴定Ag成分。检查纯度。定量测定Ab效价。常用于检测：MD，牛白血病（HCB），牛粘膜病，牛传染性鼻气管炎口蹄疫，鸡白血病，IBD5）免疫电泳（IEP）：分析成分及纯度。将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合于分析Ag的组分以及AgAb的纯度测定。方法：将等检样品加入琼脂板中小孔中进行电泳一（在琼脂板的一定地方挖一沟槽加入已知Ab一室温扩散一根据沉淀线的多少测纯度（根据沉淀弧的数量
用途１）兽医上主要用于炭疽 Ag 的测定。将这种用于测定炭疽抗原的环状 沉淀反应叫 Ascolis 反应 ２）法医上血迹的鉴定 ３）昆虫学：天敌的调查 （2）絮状沉淀反应：抗原与抗体在试管或玻片上混合，如出现絮状沉淀即 为阳性反应，常用于人医诊断梅素的康氏试验。 ２． 凝胶内沉淀反应：固相沉淀反应 （1）琼脂扩散试验 将Ａg，Ａb 分别加于到 1%以下琼脂的半固体中，当Ａg，Ａb 相遇且比例适 当时就会形成一条白色沉淀线。 １） 单向单扩散 主要用Ａg 或Ａb 的成分和定量分析。 （１）测Ａg 时，抗体＋琼脂——制板——分别打孔加入稀释后的抗原—— 根据沉淀环的大小测Ａg 的含量（２）测Ａb 时反之(将抗体混合琼脂中制成平板， 打孔，然后将抗原加入孔中，环的直径与抗原浓度成正比) ２） 单向双扩散，少用。 ３） 双向单扩散，马立克病的诊断。Ab 浇板，打孔，孔中加 Ag，测定 Ag 浓度。 ４） 双向双扩散（琼扩，AGP） 分别将Ａg，ＡＢ加入琼脂板的小孔内，双向扩散，两相相遇时出现沉淀线， 依沉淀线的有无和出现的距离判断Ａg（Ａb）的含量(沉淀线的特征与位置不仅 取决于抗原抗体的特异性，且与浓度，分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体浓 度相等，分子大小相近，则沉淀线位于两孔之中呈直线状，当抗原浓度比抗体高 时，沉淀线靠近抗体一端并增厚反之亦然。 兽医上应用最广的血清学试验，古老但准确性高，操作简便 缺点：灵敏度低，检出率低 应用：定性测定未知 Ag 或 Ab。分析鉴定 Ag 成分。检查纯度。定量测定 Ab 效价。 常用于检测：ＭＤ，牛白血病（ＨＣＢ），牛粘膜病，牛传染性鼻气管炎， 口蹄疫，鸡白血病，ＩＢＤ 5）免疫电泳（IEP）：分析成分及纯度。将琼脂电泳和双向琼脂扩散结合于 分析 Ag 的组分以及 AgAb 的纯度测定。 方法：将等检样品加入琼脂板中小孔中进行电泳—（在琼脂板的一定地方挖 一沟槽加入已知 Ab—室温扩散—根据沉淀线的多少测纯度(根据沉淀弧的数量