(4)解除代谢互锁:赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁,应此可以考虑选 育亮氨酸缺陷型,抗亮氨酸结构类似物的突变株。 (三)赖氨酸产生菌FB42的获得 在不含苏氨酸的选择性培养基上得到50株苏氨酸完全缺陷的突变株,在抗性平板上得 到200株Lysⅸx抗性突变株,经初筛、复筛后得到FB41和FB42。同出发菌株FB31相比, FB41和FB42产酸分别提高23%和19%。诱变谱系见图4-2-4 FB3l(Leu、Thr、AEC、AHV)42gL NTG(500ug/ml 30min) FB4l(Leu Thr AEC AHV) 52g/ FB42(Leu Thr AEC AHV LySHx 图4-2-4FB42菌株的诱变谱系 (四)FB42菌株对LyHx和AHV的抗性检验 FB42是在添加AHV和 LysHx的筛选平板上获得,因此具有对AHV和 LysHx的抗性 在LysH为4mgL时,FB42的相对生长仍为80%,而此时FB31几乎不生长;此外FB42 对HV的抗性也有所增加。 (五)FB41和FB42的传代实验 对FB41和FB42进行反复传代,测定其赖氨酸合成能力,结果发现(表4-2-7),FB42 遗传、发酵性能稳定,是一支较好的赖氨酸产生菌,因此进一步对影响FB42产酸的环境因 子和发酵条件进行了研究 表42-7FB41和FB42菌株的传代实验 数 菌株FB41产酸/gL152505149454343 菌株FB42产酸/gL5049514948504850 五、环境因子对FB42分泌赖氨酸的影响 (一)苏氨酸和亮氨酸对产酸的影响 FB42菌株为亮氨酸缺陷型和苏氨酸需求型,所以发酵过程中必须添加苏氨酸和亮氨酸 图4-2-5和4-2-6反映了苏氨酸和亮氨酸对FB42菌株生长和产酸的影响 实验培养基为():葡萄糖100g、硫酸铵35g、尿素2.5g、磷酸氢二钾1g、七水合 硫酸镁0.4g、七水合硫酸铁l0mg、一水合硫酸锰8mg、D-生物素50g、硫胺素200吗g 碳酸钙40g,亮氨酸和苏氨酸的浓度按实验要求定
10 (4)解除代谢互锁：赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁，应此可以考虑选 育亮氨酸缺陷型，抗亮氨酸结构类似物的突变株。 (三)赖氨酸产生菌 FB42 的获得 在不含苏氨酸的选择性培养基上得到 50 株苏氨酸完全缺陷的突变株，在抗性平板上得 到 200 株 LysHx 抗性突变株，经初筛、复筛后得到 FB41 和 FB42。同出发菌株 FB31 相比， FB41 和 FB42 产酸分别提高 23%和 19%。诱变谱系见图 4-2-4。 FB31(Leu-、Thr-、AECr、AHVr ) 42g/L NTG(500g/ml 30min) FB41(Leu- Thr- AECr AHVr ) 52g/L FB42(Leu- Thr- AECr AHVr LysHxr ) 50g/L 图 4-2-4 FB 42 菌株的诱变谱系 (四)FB42 菌株对 LysHx 和 AHV 的抗性检验 FB42 是在添加 AHV 和 LysHx 的筛选平板上获得，因此具有对 AHV 和 LysHx 的抗性， 在 LysHx 为 4mg/L 时，FB42 的相对生长仍为 80%，而此时 FB31 几乎不生长；此外 FB42 对 HV 的抗性也有所增加。 (五)FB41 和 FB42 的传代实验 对 FB41 和 FB42 进行反复传代，测定其赖氨酸合成能力，结果发现(表 4-2-7)，FB42 遗传、发酵性能稳定，是一支较好的赖氨酸产生菌，因此进一步对影响 FB42 产酸的环境因 子和发酵条件进行了研究。 表 4-2-7 FB41 和 FB42 菌株的传代实验 代数 1 2 3 4 5 6 7 8 菌株 FB41 产酸/ gL -1 52 50 51 49 45 43 43 42 菌株 FB42 产酸/ gL -1 50 49 51 49 48 50 48 50 五、环境因子对 FB42 分泌赖氨酸的影响 (一)苏氨酸和亮氨酸对产酸的影响 FB42 菌株为亮氨酸缺陷型和苏氨酸需求型，所以发酵过程中必须添加苏氨酸和亮氨酸， 图 4-2-5 和 4-2-6 反映了苏氨酸和亮氨酸对 FB42 菌株生长和产酸的影响。 实验培养基为(/L)：葡萄糖 100 g、硫酸铵 35 g、尿素 2.5 g、磷酸氢二钾 1 g、七水合 硫酸镁 0.4 g、七水合硫酸铁 10 mg、一水合硫酸锰 8 mg、D-生物素 50 ug、硫胺素 200 ug、 碳酸钙 40 g，亮氨酸和苏氨酸的浓度按实验要求定
图4-2-5苏氨酸对菌体生长和产酸的影响图4-2-6亮氨酸对菌体和产酸的影响 从图42-5中可以看出当苏氨酸浓度>150mg/L时,就能满足菌体生长的要求,实验范 围内未发现过高的苏氨酸浓度对菌体生长有抑制作用。对产酸而言,苏氨酸浓度有一合适的 值,其范围在100~350mg几之间,苏氨酸浓度过高对FB42产赖氨酸有抑制作用。对比 下本文的结果可以发现,FBA2和FB21菌株相比∶(1)菌体生长所需的苏氨酸浓度降低了 (2)苏氨酸对产酸的抑制作用也有所减小。这从一个侧面也说明:(1)由于FB42菌株为苏氨 酸需求型但不是完全缺陷,其自身可合成少量的苏氨酸,因而对苏氨酸的需求要比FB1(苏 氨酸缺陷型)少;(2)FB42对苏氨酸结构类似物AHV的抗性较FB21有所增加,故而苏氨酸 对菌体赖氨酸合成的抑制作用得到缓解。 图4-2-6反映了亮氨酸对FB42菌体生长和产酸的影响,可以看出亮氨酸对菌体生长和 产酸的影响是相似的,最适生长和产酸浓度为400-600mg/L。 (二)生物素的浓度对产酸的影响 生物素影响到细胞内细胞膜的合成,生物素过量的情况下会导致细胞中更多磷脂分子的 合成。对于谷氨酸发酵,这种作用会影响Glu-Asp运输系统向胞外运送谷氨酸,因而在谷氨 酸发酵中控制亚适量的生物素浓度被作为一种提高产酸的重要策略。对于赖氨酸发酵而ˉ 抑制谷氨酸的分泌可以使得代谢流转向赖氨酸的合成,且赖氨酸的分泌与Glu-Asp运输系统 无关,因此高的生物素浓度应该是有利的。实验发现生物素浓度必须大于250ug/L。在发酵 培养基中添加生物素对产酸影响不大,分析可知:发酵培养基中含有3%的玉米浆(玉米浆中 生物素的浓度为150ug),折算成生物素的含量为450ug几L,满足了菌体大量分泌赖氨酸的 要求,因此玉米浆在发酵培养基中除作为有机氮源外,还提供发酵所需的生物素。 图4-2-7生物素对产酸的影响 (三)金属离子对产酸的影响 许多金属离子都是微生物代谢途径上酶的激活剂或是辅助因子。如Mn2+是许多酶的激 活剂;Fe是细胞色素氧化酶和过氧化氢酶中活性基因的辅助因子;Mg2是糖酵解途径中许 多酶的激活剂。此外钾离子对产酸的影响也很大,据文献报道,钾离子对保持菌体活力,防 止菌体衰老,提高产酸能力起着相当重要的作用。也有文献报道铜离子浓度为50mg/L时, 可以提高产酸。 实验考察了镁、钾、锰、铁、铜离子对产酸的影响(表4-2-8),发现:钾离子和镁离子 对产酸有促进作用,最适的添加量分别为1gL和0.5gL(以磷酸氢二钾和七水合硫酸镁计); 铁离子和镁离子对产酸影响不大;而铜离子对产酸有抑制作用,尤其当铜离子大于20mg/L 时几乎不产赖氨酸。 表4-2-8金属离子对产酸的影响
11 图 4-2-5 苏氨酸对菌体生长和产酸的影响 图 4-2-6 亮氨酸对菌体和产酸的影响 从图 4-2-5 中可以看出当苏氨酸浓度>150 mg/L 时，就能满足菌体生长的要求，实验范 围内未发现过高的苏氨酸浓度对菌体生长有抑制作用。对产酸而言，苏氨酸浓度有一合适的 值，其范围在 100~350 mg/L 之间，苏氨酸浓度过高对 FB42 产赖氨酸有抑制作用。对比一 下本文的结果可以发现，FB42 和 FB21 菌株相比∶(1)菌体生长所需的苏氨酸浓度降低了； (2)苏氨酸对产酸的抑制作用也有所减小。这从一个侧面也说明：(1)由于 FB42 菌株为苏氨 酸需求型但不是完全缺陷，其自身可合成少量的苏氨酸，因而对苏氨酸的需求要比 FB21(苏 氨酸缺陷型)少；(2)FB42 对苏氨酸结构类似物 AHV 的抗性较 FB21 有所增加，故而苏氨酸 对菌体赖氨酸合成的抑制作用得到缓解。 图 4-2-6 反映了亮氨酸对 FB42 菌体生长和产酸的影响，可以看出亮氨酸对菌体生长和 产酸的影响是相似的，最适生长和产酸浓度为 400~600 mg/L。 (二)生物素的浓度对产酸的影响 生物素影响到细胞内细胞膜的合成，生物素过量的情况下会导致细胞中更多磷脂分子的 合成。对于谷氨酸发酵，这种作用会影响 Glu-Asp 运输系统向胞外运送谷氨酸，因而在谷氨 酸发酵中控制亚适量的生物素浓度被作为一种提高产酸的重要策略。对于赖氨酸发酵而言， 抑制谷氨酸的分泌可以使得代谢流转向赖氨酸的合成，且赖氨酸的分泌与 Glu-Asp 运输系统 无关，因此高的生物素浓度应该是有利的。实验发现生物素浓度必须大于 250 ug/L。在发酵 培养基中添加生物素对产酸影响不大，分析可知：发酵培养基中含有 3%的玉米浆(玉米浆中 生物素的浓度为 150ug/L)，折算成生物素的含量为 450ug/L，满足了菌体大量分泌赖氨酸的 要求，因此玉米浆在发酵培养基中除作为有机氮源外，还提供发酵所需的生物素。 图 4-2-7 生物素对产酸的影响 (三)金属离子对产酸的影响 许多金属离子都是微生物代谢途径上酶的激活剂或是辅助因子。如 Mn2+是许多酶的激 活剂；Fe2+是细胞色素氧化酶和过氧化氢酶中活性基因的辅助因子；Mg2+是糖酵解途径中许 多酶的激活剂。此外钾离子对产酸的影响也很大，据文献报道，钾离子对保持菌体活力，防 止菌体衰老，提高产酸能力起着相当重要的作用。也有文献报道铜离子浓度为 50 mg/L 时， 可以提高产酸。 实验考察了镁、钾、锰、铁、铜离子对产酸的影响(表 4-2-8)，发现：钾离子和镁离子 对产酸有促进作用，最适的添加量分别为 1 g/L 和 0.5 g/L(以磷酸氢二钾和七水合硫酸镁计)； 铁离子和镁离子对产酸影响不大；而铜离子对产酸有抑制作用，尤其当铜离子大于 20 mg/L 时几乎不产赖氨酸。 表 4-2-8 金属离子对产酸的影响
离子 浓度/gL1产酸/gL离子浓度/mgL产酸/gL 以K2HPO4计 1.0 Mg2+以 MgSO47H2O计 未检出 1.0 31.5 未检出 1.5 未检出 2 mg/L mg/L 32.0 8 mg/L 30.2 注:发酵培养基除实验离子外其它为(L):葡萄糖100g、硫酸铵35g、尿素2.5g、磷酸氢二钾1g、 七水合硫酸镁0.4g、七水合硫酸铁10mg、一水合硫酸锰8mg、D-生物素500ug、硫胺素200ug、Thr200 mg、Leu400mg、碳酸钙40 六、响应面分析法优化FB42菌株发酵培养基 响应面分析( Response Surface Analysis,RSA)方法是数学与统计学相结合的产物,和其 它统计方法一样,由于采用了合理的实验设计,能以最经济的方式,用很少的实验数量和时 间对实验进行全面研究,科学地提供局部与整体的关系,从而取得明确的、有目的的结论 它与过去推广的“正交设计法”不同。响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具,将 多因子实验中,因子与实验结果的相互关系,用多项式近似,把因子与实验结果(响应面)的 关系函数化,依此可对函数的面进行分析,研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互 关系,并进行优化。 Box及其合作者于20世纪50年代完善了响应面方法学,后广泛应用于化学、化工、农 业、机械工业等领域。本研究采用响应面分析方法对FB42的发酵培养基的组成进行了优化 以玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵三个因素为自变量,以赖氨酸产量为响应值,设计了三因素 水平的实验。发酵培养基中其它组成为(g/):葡萄糖150、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁 0.5、碳酸钙45 实验因素与水平选取如下 豆饼水解液(X1)-1:1%0:2% 1:3% 玉米浆 -1:2% 0:3% 1:4% 硫酸铵 (X3)-1:4% 0:5% 1:6% 15个实验点可分为两类:一是析因点,自变量取值在X1、X2、X3所构成的三维顶点 共有12个析因点:二是零点,为区域的中心点,零点实验重复三次,用以估计实验误差。 以产酸(Y)为响应值,经回归拟合后,各实验因子对响应值的影响可用下列函数表示: Y=ao+aIXI+a2x2+a3x3+aux12+a22x2+a33x32+al2X1X2+a13x1X3+a23x2X3 表4-2-9响应面实验设计安排及实验结果 试验号豆饼水解液x1玉米浆x2硫酸铵x3产酸/gL
12 离子 浓度/ gL -1 产酸/ gL -1 离子 浓度/ mgL -1 产酸/ gL -1 K+ 以 K2HPO4 计 0.5 25.2 Fe2+ 1 31.2 1.0 32.1 2 32.1 1.5 31.1 4 30.4 2.0 30.1 8 31.1 Mg2+以 MgSO47H2O 计 0.2 26.3 Cu2+ 20 30.2 0.5 32.0 40 未检出 1.0 31.5 60 未检出 1.5 29.2 80 未检出 Mn2+ 1 mg/L 31.2 2 mg/L 30.1 4 mg/L 32.0 8 mg/L 30.2 注：发酵培养基除实验离子外其它为(/L)：葡萄糖 100 g、硫酸铵 35 g、尿素 2.5 g、磷酸氢二钾 1 g、 七水合硫酸镁 0.4 g、七水合硫酸铁 10 mg、一水合硫酸锰 8 mg、D-生物素 500 ug、硫胺素 200 ug、Thr 200 mg、Leu 400 mg、碳酸钙 40 g。 六、响应面分析法优化 FB42 菌株发酵培养基 响应面分析(Response Surface Analysis，RSA)方法是数学与统计学相结合的产物，和其 它统计方法一样，由于采用了合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实验数量和时 间对实验进行全面研究，科学地提供局部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。 它与过去推广的“正交设计法”不同。响应面分析方法以回归方法作为函数估算的工具，将 多因子实验中，因子与实验结果的相互关系，用多项式近似，把因子与实验结果(响应面)的 关系函数化，依此可对函数的面进行分析，研究因子与响应面之间、因子与因子之间的相互 关系，并进行优化。 Box 及其合作者于 20 世纪 50 年代完善了响应面方法学，后广泛应用于化学、化工、农 业、机械工业等领域。本研究采用响应面分析方法对 FB42 的发酵培养基的组成进行了优化， 以玉米浆、豆饼水解液、硫酸铵三个因素为自变量，以赖氨酸产量为响应值，设计了三因素 三水平的实验。发酵培养基中其它组成为(g/L)：葡萄糖 150、磷酸氢二钾 1、七水合硫酸镁 0.5、碳酸钙 45。 实验因素与水平选取如下： 豆饼水解液 (X1) -1： 1% 0：2% 1：3% 玉米浆 (X2) -1：2% 0：3% 1：4% 硫酸铵 (X3) -1：4% 0：5% 1：6% 15 个实验点可分为两类：一是析因点，自变量取值在 X1 、X2、X3 所构成的三维顶点， 共有 12 个析因点；二是零点，为区域的中心点，零点实验重复三次，用以估计实验误差。 以产酸(Y)为响应值，经回归拟合后，各实验因子对响应值的影响可用下列函数表示： Y=a0+a1x1+a2x2+a3x3+a11x1 2+a22x2 2+a33x3 2+a12x1x2+a13x1x3+a23x2x3 表 4-2-9 响应面实验设计安排及实验结果 试验号 豆饼水解液 x1 玉米浆 x2 硫酸铵 x3 产酸/ gL -1 1 -1 -1 0 45.44 2 -1 0 -1 49.01 3 -1 0 1 48.20
04470 6 42.21 000 l11 39.96 11 39.80 35.02 000 001000 54.20 15 53.54 表4-2-10回归系数取值 系数 取值5406-4117-1.299-02362-4973-8015-4725-0.84500039903875 表4-2-11回归方程的方差分析表 方差来源自由度平方和均方F值 相关系数r2 回归 514.6 57.17380.7 =514.6/515.3 残差 0.751 0.150 =0.998 总离差 14 515.3 Fo01(9,5)=10.2 表42-12回归方程各项的方差分析表 方差来源自由度均方F值显著性 次项 二次项 120.5545.2 交互项 1545.22 失拟项 33332 0.1030466 误差 0.221 Fo01(3,2)=99.2F005(3,2)=19.2Fo(3,2)=9.16 从方差分析表可以看出,用上述回归方程描述各因子与响应面之间的关系时,其因变量 与全体自变量之间的线性关系是显著的(F>f05(9,5),方程的失拟项很小,因此可以用该回 归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。回归方程各项的方差分析结果还表明,方程一 次项、二次项的影响都是高度显著的,因此各个具体实验因子对响应值的影响不是简单的线 性关系,各因子之间的交互作用影响不显著
13 4 -1 1 0 44.70 5 0 -1 -1 43.20 6 0 -1 1 42.21 7 0 1 -1 39.96 8 0 1 1 40.22 9 1 -1 0 39.14 10 1 0 -1 40.45 11 1 0 1 39.80 12 1 1 0 35.02 13 0 0 0 54.20 14 0 0 0 54.45 15 0 0 0 53.54 表 4-2-10 回归系数取值 系数 a0 a1 a2 a3 a11 a22 a33 a12 a13 a23 取值 54.06 -4.117 -1.299 -0.2362 -4.973 -8.015 -4.725 -0.8450 0.0399 0.3875 表 4-2-11 回归方程的方差分析表 方差来源 自由度 平方和 均方 F 值 相关系数 r 2 回归 9 514.6 57.17 380.7 r 2=514.6/515.3 残差 5 0.751 0.150 =0.998 总离差 14 515.3 F0.01(9, 5)=10.2 表 4-2-12 回归方程各项的方差分析表 方差来源 自由度 均方 F 值 显著性 一次项 3 49.86 225.6 二次项 3 120.5 545.2 交互项 3 1.154 5.222 失拟项 3 0.103 0.466 误差 2 0.221 F0.01(3, 2)=99.2 F0.05(3, 2)=19.2 F0.1(3, 2)=9.16 从方差分析表可以看出，用上述回归方程描述各因子与响应面之间的关系时，其因变量 与全体自变量之间的线性关系是显著的(F>f0.05(9, 5))，方程的失拟项很小，因此可以用该回 归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。回归方程各项的方差分析结果还表明，方程一 次项、二次项的影响都是高度显著的，因此各个具体实验因子对响应值的影响不是简单的线 性关系，各因子之间的交互作用影响不显著
图42-8Y=f(X1,X2)响应面分析平面图图42-9Y=f(X1,X3)响应面分析平面图 (硫酸铵X3=5%) 图4-2-10Y=f(X1,X2)响应面分析立体图图4-2-11Y=f(X1,X3)响应面分析立体图 (硫酸铵X3=5%) (玉米浆X2=3%) 从响应面分析图中可以看出,硫酸铵浓度的变化对产酸的影响不显著,其最佳值在5% 左右:玉米浆和豆饼水解液浓度的变化对产酸有较大的影响,二者相比玉米浆浓度的变化对 产酸的影响更为明显,从图中可以看出玉米浆的最适值在3%左右,豆饼水解液的最适值在 1.5~2%之间。为了更进一步确证最佳点的值,对回归方程取一阶偏导,令其等于零并整理 得 4.177-9946X1+0.0399X3-0.845X2=0 -1.299-1603X2+0.3875X3-0.845X1=0 0.2362-9450X3+0.0399X1-0.388X2=0 解得:x1=-0.41x2=0.08X=0.02 即:豆饼水解液为1.59%、玉米浆为2.92%、硫酸铵4.98%。考虑到实际配制的方便 得到较佳的发酵培养基组成为g/L):葡萄糖150、玉米浆30、豆饼水解液20、硫酸铵50 磷酸氢二钾Ⅰ、七水合硫酸镁θ5、碳酸钙45,FB42菌株在此培养基中摇瓶发酵ηh,赖 氨酸产量为541g/L,转化率为0.36g/g
14 图 4-2-8 Y=f(X1, X2)响应面分析平面图 图 4-2-9 Y=f(X1, X3)响应面分析平面图 (硫酸铵 X3=5%) (玉米浆 X2=3%) 图 4-2-10 Y=f(X1, X2)响应面分析立体图 图 4-2-11 Y=f(X1, X3)响应面分析立体图 (硫酸铵 X3=5%) (玉米浆 X2=3%) 从响应面分析图中可以看出，硫酸铵浓度的变化对产酸的影响不显著，其最佳值在 5% 左右；玉米浆和豆饼水解液浓度的变化对产酸有较大的影响，二者相比玉米浆浓度的变化对 产酸的影响更为明显，从图中可以看出玉米浆的最适值在 3%左右，豆饼水解液的最适值在 1.5~2%之间。为了更进一步确证最佳点的值，对回归方程取一阶偏导，令其等于零并整理 得： -4.177 - 9.946 X1 + 0.0399 X3 - 0.845 X2=0 -1.299 - 16.03 X2 + 0.3875 X3 - 0.845 X1=0 -0.2362 - 9.450 X3 + 0.0399 X1 - 0.388 X2=0 解得：x1=-0.41 x2=-0.08 x3=-0.02 即：豆饼水解液为 1.59% 、玉米浆为 2.92%、硫酸铵 4.98%。考虑到实际配制的方便， 得到较佳的发酵培养基组成为(g/L)：葡萄糖 150、玉米浆 30、豆饼水解液 20、硫酸铵 50、 磷酸氢二钾 1、七水合硫酸镁 0.5、碳酸钙 45，FB 42 菌株在此培养基中摇瓶发酵 72 h，赖 氨酸产量为 54.1 g/L，转化率为 0.36 g/g