第三节连续培养中FB42菌株的动力学特性及其代谢流分析 、引言 连续培养的起源可以追溯到20世纪初。1942年 Monod发表了一篇关于细菌连续培养 的文章,随后于1949年提出了著名的 Monod方程。经过半个世纪的研究,人们对连续培养 操作的特性已有了较为深入的了解。连续培养技术除了在发酵生产中被用来提高生产强度 外,在理论研究方面也作为一种重要的研究手段而被广泛应用。这是因为在连续培养中各种 条件相对稳定,可以有目的、定量地调查各种变量之间的相互关系,并可较为精确地求出 些发酵过程的重要动力学参数,这些动力学参数不依赖于培养条件,通常在分批发酵和流加 发酵中很难得出的。 有关赖氨酸发酵的研究,以往的工作主要着重于通过诱变和筛选的方法,获得高产菌种 提高发酵单位,但对菌种特性的进一步研究甚少。对发酵过程的考察指标仅仅局限于产酸和 表观总转化率,对一些重要的动力学数据如基质消耗比速、产物形成比速、菌体生长比速及 其它们之间的相互关系缺乏了解,因此很难对发酵过程进行精确控制,不利于进一步发挥菌 种的潜能。要想发挥菌种的潜能必须了解菌种的潜能到底有多大,即菌种真实转化率的值等 于多大?这个值对发酵过程优化与控制的研究是非常重要的。发酵过程优化的目的是使发酵 水平接近真实转化率,如果对不能确定该值,发酵过程的优化就具有很大的盲目性 此外,发酵过程的理论转化率是一个重要的物理参数。理论转化率和真实转化率是两个 不同的概念,理论转化率代表了菌体最有效地利用外界物质和能量的过程,是热力学意义上 的最大可能性,是一个确定的值,而真实转化率则具有菌体的特异性,根据两者的差异可对 目的菌株的代谢流进行分析,用以指导生产和菌株的改造。但是由于微生物代谢途径的复杂 性,而且理论转化率往往无法通过实验直接得出,因此目前有关赖氨酸理论转化率的报道众 说纷纭,有必要进行更加深入的研究。本节即以连续培养方法作为研究手段,对上述问题进 行了研究,为下一步对发酵过程优化控制的研究打下了基础。 二、连续培养中的操作特性 营养缺陷型菌株,特别是基因工程菌,在连续传代过程中存在着自然回复突变和质粒脱 落现象,因此在连续培养中稳态操作可分为两个过程:开始的一段亚稳态和回复突变后达到 的另一个最终稳态点。为了能真实反映菌体大量分泌赖氨酸的生长、代谢特性,这里仅仅讨 论开始的一段亚稳态。 图43-1和图432为稀释率0.155h和0.l8h1时,实验操作过程中各参数的变化图, 可以看出,当经过3~5个停留时间后能得到稳定的操作 图43-1实验操作过程中各参数的变化图43-2实验操作过程中各参数的变化 (D=0.155h2) D=0.181h2) (一)菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系
15 第三节 连续培养中 FB42 菌株的动力学特性及其代谢流分析 一、引言 连续培养的起源可以追溯到 20 世纪初。1942 年 Monod 发表了一篇关于细菌连续培养 的文章，随后于 1949 年提出了著名的 Monod 方程。经过半个世纪的研究，人们对连续培养 操作的特性已有了较为深入的了解。连续培养技术除了在发酵生产中被用来提高生产强度 外，在理论研究方面也作为一种重要的研究手段而被广泛应用。这是因为在连续培养中各种 条件相对稳定，可以有目的、定量地调查各种变量之间的相互关系，并可较为精确地求出一 些发酵过程的重要动力学参数，这些动力学参数不依赖于培养条件，通常在分批发酵和流加 发酵中很难得出的。 有关赖氨酸发酵的研究，以往的工作主要着重于通过诱变和筛选的方法，获得高产菌种， 提高发酵单位，但对菌种特性的进一步研究甚少。对发酵过程的考察指标仅仅局限于产酸和 表观总转化率，对一些重要的动力学数据如基质消耗比速、产物形成比速、菌体生长比速及 其它们之间的相互关系缺乏了解，因此很难对发酵过程进行精确控制，不利于进一步发挥菌 种的潜能。要想发挥菌种的潜能必须了解菌种的潜能到底有多大，即菌种真实转化率的值等 于多大？这个值对发酵过程优化与控制的研究是非常重要的。发酵过程优化的目的是使发酵 水平接近真实转化率，如果对不能确定该值，发酵过程的优化就具有很大的盲目性。 此外，发酵过程的理论转化率是一个重要的物理参数。理论转化率和真实转化率是两个 不同的概念，理论转化率代表了菌体最有效地利用外界物质和能量的过程，是热力学意义上 的最大可能性，是一个确定的值，而真实转化率则具有菌体的特异性，根据两者的差异可对 目的菌株的代谢流进行分析，用以指导生产和菌株的改造。但是由于微生物代谢途径的复杂 性，而且理论转化率往往无法通过实验直接得出，因此目前有关赖氨酸理论转化率的报道众 说纷纭，有必要进行更加深入的研究。本节即以连续培养方法作为研究手段，对上述问题进 行了研究，为下一步对发酵过程优化控制的研究打下了基础。 二、连续培养中的操作特性 营养缺陷型菌株，特别是基因工程菌，在连续传代过程中存在着自然回复突变和质粒脱 落现象，因此在连续培养中稳态操作可分为两个过程：开始的一段亚稳态和回复突变后达到 的另一个最终稳态点。为了能真实反映菌体大量分泌赖氨酸的生长、代谢特性，这里仅仅讨 论开始的一段亚稳态。 图 4-3-1 和图 4-3-2 为稀释率 0.155 h-1 和 0.18 h-1 时，实验操作过程中各参数的变化图， 可以看出，当经过 3~5 个停留时间后能得到稳定的操作。 图 4-3-1 实验操作过程中各参数的变化 图 4-3-2 实验操作过程中各参数的变化 (D=0.155 h-1 ) (D=0.181 h -1 ) (一)菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系
如图4-3-3所示。总的来说,随着稀释率的增加,菌体浓度呈下降的趋势,特别是当 D>0.15h后菌体浓度下降很快。在D<0.15h1时产物的浓度几乎保持不变,但当D>0.l5h1 后,随着菌体浓度的下降,产物浓度也迅速下降。与D=0.05h时相比,D=022h1时的菌 体浓度值下降了39%,产物浓度值降低了52%,可见过高的稀释率对产物的形成的负面影 响更大 图4-3-3菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系 当D<O.llh时,限制性基质葡萄糖的浓度未检出(<l0mg/L)。 Linton等在以葡萄糖为 限制性基质研究 Penicillin stipitate青霉素发酵动力学特性时,实验数据表明在很宽的稀释 率范围内葡萄糖浓度均在检测限以下(<5mg),和本研究在较低稀释率下出现的现象相似 其原因可能是,在较低的稀释率下,葡萄糖很快被转化为代谢过程中的中间产物,这时葡萄 糖的限制作用,可能有其代谢途径上的某一中间产物表现出来。当D>0.llhl时,葡萄糖浓 度开始增加,当D=0.22h时葡萄糖浓度急剧升高,此时菌体浓度、产物的下降也很快,说 明该点已很接近洗出点。 (二)产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 如图434所示。产物形成比速和稀释率之间存在着一个函数关系。当D<0.15h1时 产物形成比速随D增加呈线性增大;当D处于0.15h10.18h1之间时,产物形成比速虽然 继续增加,但趋势变得缓慢:产物形成比速的最大值出现在D=0.18h附近,当D>O.l8hˉ 后,产物形成比速呈下降的趋势 图4-3-4产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 葡萄糖的消耗比速和产物形成比速有一对应关系。在产物形成比速线性增加的区域内, 葡萄糖的消耗比速也呈线性増加:当产物形成比速呈下降趋势后,葡萄糖消耗比速增加的幅 度变慢。这是因为葡萄糖不但用作菌体的生长,还用于产物的形成 (三)菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 如图43-5所示。D在005h1~0.15h1之间变化时,菌体的表观转化率似有下降:当D
16 如图 4-3-3 所示。总的来说，随着稀释率的增加，菌体浓度呈下降的趋势，特别是当 D>0.15 h-1 后菌体浓度下降很快。在 D<0.15 h-1 时产物的浓度几乎保持不变，但当 D>0.15 h-1 后，随着菌体浓度的下降，产物浓度也迅速下降。与 D=0.05 h-1 时相比，D=0.22 h-1 时的菌 体浓度值下降了 39%，产物浓度值降低了 52%，可见过高的稀释率对产物的形成的负面影 响更大。 图 4-3-3 菌体浓度、产物浓度、基质浓度与稀释率的关系 当 D<0.11 h-1 时，限制性基质葡萄糖的浓度未检出(<10 mg/L)。Linton 等在以葡萄糖为 限制性基质研究 Penicillim stipitatum 青霉素发酵动力学特性时，实验数据表明在很宽的稀释 率范围内葡萄糖浓度均在检测限以下(<5 mg/L)，和本研究在较低稀释率下出现的现象相似。 其原因可能是，在较低的稀释率下，葡萄糖很快被转化为代谢过程中的中间产物，这时葡萄 糖的限制作用，可能有其代谢途径上的某一中间产物表现出来。当 D>0.11 h-1 时，葡萄糖浓 度开始增加，当 D=0.22 h-1 时葡萄糖浓度急剧升高，此时菌体浓度、产物的下降也很快，说 明该点已很接近洗出点。 (二)产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 如图 4-3-4 所示。产物形成比速和稀释率之间存在着一个函数关系。当 D<0.15 h-1 时， 产物形成比速随 D 增加呈线性增大；当 D 处于 0.15 h-1~0.18 h-1 之间时，产物形成比速虽然 继续增加，但趋势变得缓慢；产物形成比速的最大值出现在 D=0.18h-1 附近，当 D>0.18 h-1 后，产物形成比速呈下降的趋势。 图 4-3-4 产物生成比速、基质消耗比速与稀释率的变化关系 葡萄糖的消耗比速和产物形成比速有一对应关系。在产物形成比速线性增加的区域内， 葡萄糖的消耗比速也呈线性增加；当产物形成比速呈下降趋势后，葡萄糖消耗比速增加的幅 度变慢。这是因为葡萄糖不但用作菌体的生长，还用于产物的形成。 (三)菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 如图 4-3-5 所示。D 在 0.05 h-1～0.15 h-1 之间变化时，菌体的表观转化率似有下降；当 D
进一步增大时,菌体的表观转化率略有提高,但总的来说菌体的表观转化率的随着稀释率的 变化不很明显。 产物表观转化率的变化和菌体表观转化率的变化呈相反的趋势。D从0.05h1增加到015 h时产物的表观转化率略有提高,D>0.15h后产物的表观转化率大幅度下降。造成产物转 化率急剧的下降的原因还不很清楚,但极有可能是在很高的稀释率下,菌体浓度和产物浓度 很小,发酵液中培养基的利用不很充分,这样对产酸有抑制的物质如苏氨酸、亮氨酸的浓度 相对较高,影响到赖氨酸的大量分泌。 通过前面的分析可以看出,对于产物的形成,稀释率有一个较适的值,当D=015h1左 右时,发酵液中产物的浓度较高,产物的形成比速也较大,此时也对应着产物的最大表观率 实验发现过高的稀释率对产物的形成尤为不利 图4-3-5菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 Yx:★Y 、连续培养中赖氨酸发酵的动力学特性 (一)菌体生长动力学 949年 Monod在研究细菌连续培养时根据如下假定:(1)生长为平衡式的非结构生长 (为了描述菌体成分,采用菌体浓度作为唯一变量);(2)只着眼于培养基中一种成分—生长 限制性底物,其它成分的含量都充分,达到不致影响生长的程度:(3)认为生长是个单一反 应,菌体得率一定,不存在动态的滞后现象。据此得出了著名的 Monod的方程 S u=u 式中:μ:菌体的比生长速率 umax:菌体的最大比生长速率 Ks半饱和常数 S:限制性基质浓度 由此揭开了对微生物生长乃至发酵动力学研究的序幕。尽管某些生长过程中,尚有可能 存在多个限制生长因素,或高浓度底物抑制、或产物抑制、或多底物竞争、或多种微生物间 的竞争等许多问题,但在一般条件下,特别是在产物抑制不明显的连续培养中, Monod方 程表现出广泛的适用性。 对于一个单级全混反应器(CSTR,有关菌体(不计死亡)的物料衡算式为 V(dx/dt)=FX0-FX+μXV (4-3-2) 式中:V:反应器中培养液的体积 F:培养液流入(出)的速度 X0:流入培养液中的菌体浓度 X:反应器内的菌体浓度 般X0=0,所以式(4-3-2)整理得
17 进一步增大时，菌体的表观转化率略有提高，但总的来说菌体的表观转化率的随着稀释率的 变化不很明显。 产物表观转化率的变化和菌体表观转化率的变化呈相反的趋势。D从0.05 h-1增加到0.15 h -1 时产物的表观转化率略有提高，D>0.15 h -1 后产物的表观转化率大幅度下降。造成产物转 化率急剧的下降的原因还不很清楚，但极有可能是在很高的稀释率下，菌体浓度和产物浓度 很小，发酵液中培养基的利用不很充分，这样对产酸有抑制的物质如苏氨酸、亮氨酸的浓度 相对较高，影响到赖氨酸的大量分泌。 通过前面的分析可以看出，对于产物的形成，稀释率有一个较适的值，当 D=0.15 h-1 左 右时，发酵液中产物的浓度较高，产物的形成比速也较大，此时也对应着产物的最大表观率。 实验发现过高的稀释率对产物的形成尤为不利。 图 4-3-5 菌体和产物表观转化率与稀释率的变化关系 □ Yx；＊Yp 三、连续培养中赖氨酸发酵的动力学特性 (一)菌体生长动力学 1949 年 Monod 在研究细菌连续培养时根据如下假定：(1)生长为平衡式的非结构生长 (为了描述菌体成分，采用菌体浓度作为唯一变量)；(2)只着眼于培养基中一种成分──生长 限制性底物，其它成分的含量都充分，达到不致影响生长的程度；(3)认为生长是个单一反 应，菌体得率一定，不存在动态的滞后现象。据此得出了著名的 Monod 的方程： k S S S + = max (4-3-1) 式中：：菌体的比生长速率 max：菌体的最大比生长速率 Ks：半饱和常数 S：限制性基质浓度 由此揭开了对微生物生长乃至发酵动力学研究的序幕。尽管某些生长过程中，尚有可能 存在多个限制生长因素，或高浓度底物抑制、或产物抑制、或多底物竞争、或多种微生物间 的竞争等许多问题，但在一般条件下，特别是在产物抑制不明显的连续培养中，Monod 方 程表现出广泛的适用性。 对于一个单级全混反应器(CSTR)，有关菌体(不计死亡)的物料衡算式为： V(dX/dt)=FX0-FX + XV (4-3-2) 式中： V：反应器中培养液的体积 F：培养液流入(出)的速度 X0：流入培养液中的菌体浓度 X：反应器内的菌体浓度 一般 X0=0，所以式(4-3-2)整理得: