第二节赖氨酸生产菌FB42的获得 、引言 20世纪50年代以后赖氨酸的微生物合成途径逐步被阐明,在此基础上的代谢控制发酵 的硏究非常活跃,以选育营养缺陷型及多重结构类似物抗性突变株为主的常规育种技术,给 赖氨酸发酵工业奠定了基础。我们曾于1988年选育岀一株赖氨酸产生菌FB21,该菌株的产 酸当时为国内领先水平,后研究工作一度中断,菌种退化很多,因此有必要对其遗传标记进 行检査,并进一步提高其产酸能力。另一方面,在摇瓶条件下,易于考察各营养因子对微生 物代谢的影响,选择出合适的培养基组成,同时可进行一些初步的优化工作,为以后的研究 打下基础。 二、出发菌株FB21的遗传特性 赖氨酸产生菌黄色短杆菌( Bervibacterium flavum)FB2l是由无锡轻工大学经多年筛选于 1988年获得,诱变谱系见图4-2-1,其中FB16到FB21是经原生质体诱变。据报道,FB21 菌株在糖浓度为18%下发酵88h,产酸达到7%,为当时国内领先水平, 黄色短杆菌( Bervibacterium flavum) Lys. HCI产量 ASl.495(Leu) F6-16(1 20.8g/L NTG F9-50(Leu Thr AEC 33.5g/L NTG F10-102( Leu Thr AEC SD) 高糖驯化 Fll-519( Leu Thr AEC SD 44.1 g/L NTG F16(Leu Thr AEC SD Str) 520g/L DES⊥原生质体诱变 FB20(Leu Thr AEC SD Str AHV) 65.0 自然分离 FB21(Leu Thr AEC SD Str AHV 图4-2-1黄色短杆菌FB21的诱变谱系 本研究出发菌株FB31是由FB21的保藏斜面中接出,经复壮、分离、纯化后获得。由 于FB21保藏时间过长,所获得的FB31其遗传特性极有可能发生改变,FB21的主要遗传标 记为 LeuthrAECAHV,对这四种标记进行鉴定,发现FB31菌株的生长需要Thr和Leu。 在不含Leu的培养基中FB31菌株完全不生长,表现为Leu缺陷型;在不含Thr的培养基 中,FB31菌株能微弱生长,但生长不充分,表现为Thr生长需求型(也可称为代谢渗透缺陷 型)。在AEC浓度为10mgL时,FB31菌株的生长几乎不受影响:在AHV浓度为2mg/L 时,FB31的相对生长为50%,这些均和FB21的报道相一致。通过遗传特性的鉴别可以看 出,FB31基本上保留了FB21的遗传标记,但h标记发生了改变,由缺陷型变为需求型, FB3l的主要遗传标记为Thr、AEC、AHV 三、FB31菌株摇瓶发酵性能的初步研究 (一)种龄的确定 5
5 第二节 赖氨酸生产菌 FB42 的获得 一、引言 20 世纪 50 年代以后赖氨酸的微生物合成途径逐步被阐明，在此基础上的代谢控制发酵 的研究非常活跃，以选育营养缺陷型及多重结构类似物抗性突变株为主的常规育种技术，给 赖氨酸发酵工业奠定了基础。我们曾于 1988 年选育出一株赖氨酸产生菌 FB21，该菌株的产 酸当时为国内领先水平，后研究工作一度中断，菌种退化很多，因此有必要对其遗传标记进 行检查，并进一步提高其产酸能力。另一方面，在摇瓶条件下，易于考察各营养因子对微生 物代谢的影响，选择出合适的培养基组成，同时可进行一些初步的优化工作，为以后的研究 打下基础。 二、出发菌株 FB21 的遗传特性 赖氨酸产生菌黄色短杆菌(Bervibacterium flavum)FB21 是由无锡轻工大学经多年筛选于 1988 年获得，诱变谱系见图 4-2-1，其中 FB16 到 FB21 是经原生质体诱变。据报道，FB21 菌株在糖浓度为 18%下发酵 88 h，产酸达到 7%，为当时国内领先水平。 黄色短杆菌(Bervibacterium flavum) LysHCl 产量 AS1.495 ( Leu- ) 2 g/L DES F6-16 ( Leu- Thr- ) 20.8 g/L NTG F9-50 (Leu- Thr- AECr ) 33.5 g/L NTG F10-102 ( Leu- Thr- AECr SDr ) 36.4 g/L 高糖驯化 F11-519 ( Leu- Thr- AECr SDr ) 44.1 g/L NTG F16 (Leu- Thr- AECr SDr Strr ) 52.0 g/L DES 原生质体诱变 FB20 (Leu- Thr- AECr SDr Strr AHVr ) 65.0 g/L 自然分离 FB21 (Leu- Thrr AECr SDr Strr AHVr ) 70.0 g/L 图 4-2-1 黄色短杆菌 FB21 的诱变谱系 本研究出发菌株 FB31 是由 FB21 的保藏斜面中接出，经复壮、分离、纯化后获得。由 于 FB21 保藏时间过长，所获得的 FB31 其遗传特性极有可能发生改变，FB21 的主要遗传标 记为 Leu-Thr -AECrAHVr，对这四种标记进行鉴定，发现 FB31 菌株的生长需要 Thr 和 Leu 。 在不含 Leu 的培养基中 FB31 菌株完全不生长，表现为 Leu 缺陷型；在不含 Thr 的培养基 中，FB31 菌株能微弱生长，但生长不充分，表现为 Thr 生长需求型(也可称为代谢渗透缺陷 型)。在 AEC 浓度为 10 mg/L 时，FB31 菌株的生长几乎不受影响；在 AHV 浓度为 2 mg/L 时，FB31 的相对生长为 50%，这些均和 FB21 的报道相一致。通过遗传特性的鉴别可以看 出，FB31 基本上保留了 FB21 的遗传标记，但 Th 标记发生了改变，由缺陷型变为需求型， FB31 的主要遗传标记为 Thr -、AECr、AHVr。 三、FB31 菌株摇瓶发酵性能的初步研究 (一)种龄的确定
适宜的种龄应是菌体处于对数生长的中后期。这是因为处于对数生长期的菌体接种进行 发酵是能迅速生长,有利于缩短发酵周期。而且对数生长期末菌体浓度相对较高,更有利于 保持高的接种量。图4-2-2为FB31种子培养的生长曲线,从图中可以看出培养进行到17~19 h时,FB31菌株处于对数生长期末,所以选择种龄为17~19h。 图4-2-2FB31菌株在种子培养基中的生长曲线 (二)接种量对发酵的影响 培养17~19h的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基中,实验结果如表4-2-1所示, 表明接种量以5%为好 表42-1不同接种量对发酵的影响 接种量/1 产酸/gL134.538841.836.0344 进一步研究发现最适的接种量很大程度上与种子的生长情况有关,实验结果如表4-2-2 所示。当种子OD值为018-~020时接种量以5%为好;当种子OD值较低,如OD值为0.085 时,接种量则以8%为宜。 表4-2-2种子OD值不同时接种量对发酵的影响 17~19h种子OD值 0.085 0.1 0.20 接种量/% 产量/gL 34.6 41.1 3 35.0 42.0 事实上由于温差、斜面接种量波动或其它因素的影响,种子培养17~19h后OD值的发 生改变是很难免的,而且有时会相差很大,这时可以通过改变接种量,或延长种子培养时间 来调整,以获得最佳的接种效果,保证发酵的稳产高产。 (三)初糖浓度对发酵的影响 如表42-3所示。当初糖浓度为13%时发酵的转化率最高,初糖浓度进一步提高时对发 酵不利,特别当初糖浓度为18%时FB3Ⅰ几乎不产酸,可见菌株不具备耐高糖的特性。 表42-3初糖浓度对发酵的影响 初糖浓度/gLl 105.0128.0148.0178.0 32.641.642.0 17.2 转化率/% 31.032.528.3 (四)发酵培养基的优化 FB31的发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐等。碳源主要由葡萄糖提供:玉米 浆、豆饼水解液、(、NH)3SO4用以提供氮源;无机盐有磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙 其中碳酸钙除用作钙盐外主要是起pH缓冲作用,使得发酵过程pH不致过低。固定培养基 组成为葡萄糖13%、磷酸氢二钾0.1%、七水合硫酸镁005%、碳酸钙4.5%,考察了玉米浆
6 适宜的种龄应是菌体处于对数生长的中后期。这是因为处于对数生长期的菌体接种进行 发酵是能迅速生长，有利于缩短发酵周期。而且对数生长期末菌体浓度相对较高，更有利于 保持高的接种量。图 4-2-2 为 FB31 种子培养的生长曲线，从图中可以看出培养进行到 17~19 h 时，FB31 菌株处于对数生长期末，所以选择种龄为 17~19 h。 图 4-2-2 FB31 菌株在种子培养基中的生长曲线 (二)接种量对发酵的影响 培养 17~19 h 的新鲜种子按不同的接种量接入发酵培养基中，实验结果如表 4-2-1 所示， 表明接种量以 5%为好。 表 4-2-1 不同接种量对发酵的影响 接种量/% 1 3 5 8 10 产酸/gL -1 34.5 38.8 41.8 36.0 34.4 进一步研究发现最适的接种量很大程度上与种子的生长情况有关，实验结果如表 4-2-2 所示。当种子 OD 值为 0.18~0.20 时接种量以 5%为好；当种子 OD 值较低，如 OD 值为 0.085 时，接种量则以 8%为宜。 表 4-2-2 种子 OD 值不同时接种量对发酵的影响 17~19 h 种子 OD 值 0.085 0.185 0.20 接种量/% 5 8 5 8 5 8 产量/ gL -1 34.6 41.1 41.3 35.0 42.0 35.1 事实上由于温差、斜面接种量波动或其它因素的影响，种子培养 17~19 h 后 OD 值的发 生改变是很难免的，而且有时会相差很大，这时可以通过改变接种量，或延长种子培养时间 来调整，以获得最佳的接种效果，保证发酵的稳产高产。 (三)初糖浓度对发酵的影响 如表 4-2-3 所示。当初糖浓度为 13%时发酵的转化率最高，初糖浓度进一步提高时对发 酵不利，特别当初糖浓度为 18%时 FB31 几乎不产酸，可见菌株不具备耐高糖的特性。 表 4-2-3 初糖浓度对发酵的影响 初糖浓度/ gL -1 105.0 128.0 148.0 178.0 产酸/ gL -1 32.6 41.6 42.0 17.2 转化率/% 31.0 32.5 28.3 9.6 (四)发酵培养基的优化 FB 31 的发酵培养基成分包括碳源、氮源、无机盐等。碳源主要由葡萄糖提供；玉米 浆、豆饼水解液、(NH4)2SO4 用以提供氮源；无机盐有磷酸氢二钾、七水合硫酸镁和碳酸钙， 其中碳酸钙除用作钙盐外主要是起 pH 缓冲作用，使得发酵过程 pH 不致过低。固定培养基 组成为葡萄糖 13%、磷酸氢二钾 0.1%、七水合硫酸镁 0.05%、碳酸钙 4.5%，考察了玉米浆
豆饼水解液和硫酸铵对发酵影响,选用L4正交表,结果如表4-2-4 表4-2-4正交实验结果 实验号豆饼水解液玉米浆NHSO:|产酸g 1(2.5% (3%) 21.0 2(1.0%) 2(3.0%)2(4%) 42.0 3 3(1.5%) 3(3.5%)3(5%) 4 38.0 3 22.0 6 3 24.0 8 1 36.0 9 30.0 28.0 33.0 37.0 31.0 26.0 35.0 极差 5.0 11.0 l10 表42-5方差分析表 方差来源偏差平方和自由度均方F值显著性 豆饼水解液5.51 2.76 23.0 玉米浆 20.47 硫酸铵 2143 2 10.7289.3 0.12 总和 47.73 F0(2,2)=990F0(2,2)=190 从正交实验结果可以看出,豆饼水解液、玉米浆、硫酸铵浓度的变化对发酵都有显著的 影响。豆饼水解液和玉米浆用以提供有机氮和FB31生长所必需的氨基酸,因此添加量过少 对发酵不利,但过高的添加量也会使产酸下降,这可能是因为在过多的添加量下发酵液中其 它氨基酸浓度的增大对FB3Ⅰ菌株合成赖氨酸有抑制作用。此外,从实验结果来看,玉米浆 浓度过高对发酵尤为不利,这可能是因为玉米浆除用以提供有机氮外,还含有大量菌体生长 所必需的因子,在过高的玉米浆浓度下,菌体生长过旺不利产酸。对黄色短杆菌的赖氨酸发 酵,硫酸铵是最好的无机氮源,有结果表明提高硫酸铵的浓度有刺激产酸的作用。本实验结 果表明对于FB31的赖氨酸发酵,硫酸铵浓度有一最佳值为4%,当硫酸铵进一步提高对发 酵影响不大。 实验得出FB31菌株发酵培养基的最适组成为(gL):葡萄糖130、玉米浆30、豆饼水解 液10、硫酸铵40、磷酸氢二钾1、七水合硫酸镁0.5、碳酸钙45。用该培养基发酵7h, 酸为42gL,和菌株FB21相比其产酸性能下降很多 保持高产菌株遗传性能的稳定,防止回复突变,是发酵工业生产中一个非常重要的问题 目前通常采用的一些方法有 (1)选育遗传性能稳定的菌株:经诱变处理后,在易出现回复突变株的培养基中反复传 代,选出不发生回复突变的菌株 (2)定向赋加生产菌的遗传标记:如选育双缺菌株,增加抗回复突变性能:对于抗性株, 尽量选育多重抗性突变株
7 豆饼水解液和硫酸铵对发酵影响，选用 L3 4 正交表，结果如表 4-2-4。 表 4-2-4 正交实验结果 实验号 豆饼水解液 玉米浆 (NH4)2SO4 产酸(g/L) 1 1(0.5%) 1(2.5%) 1(3%) 21.0 2 2(1.0%) 2(3.0%) 2(4%) 42.0 3 3(1.5%) 3(3.5%) 3(5%) 31.0 4 1 2 2 38.0 5 2 3 1 22.0 6 3 2 1 33.0 7 1 3 2 24.0 8 2 1 3 36.0 9 3 2 1 30.0 K1 28.0 30.0 24.0 K2 33.0 37.0 33.0 K3 31.0 26.0 35.0 极差 5.0 11.0 11.0 表 4-2-5 方差分析表 方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F 值 显著性 豆饼水解液 5.51 2 2.76 23.0 玉米浆 20.47 2 10.24 85.3 硫酸铵 21.43 2 10.72 89.3 误差 0.32 2 0.12 总和 47.73 8 F0.01(2,2)=99.0 F0.05(2,2)=19.0 从正交实验结果可以看出，豆饼水解液、玉米浆、硫酸铵浓度的变化对发酵都有显著的 影响。豆饼水解液和玉米浆用以提供有机氮和 FB31 生长所必需的氨基酸，因此添加量过少 对发酵不利，但过高的添加量也会使产酸下降，这可能是因为在过多的添加量下发酵液中其 它氨基酸浓度的增大对 FB31 菌株合成赖氨酸有抑制作用。此外，从实验结果来看，玉米浆 浓度过高对发酵尤为不利，这可能是因为玉米浆除用以提供有机氮外，还含有大量菌体生长 所必需的因子，在过高的玉米浆浓度下，菌体生长过旺不利产酸。对黄色短杆菌的赖氨酸发 酵，硫酸铵是最好的无机氮源，有结果表明提高硫酸铵的浓度有刺激产酸的作用。本实验结 果表明对于 FB31 的赖氨酸发酵，硫酸铵浓度有一最佳值为 4%，当硫酸铵进一步提高对发 酵影响不大。 实验得出 FB31 菌株发酵培养基的最适组成为(g/L )：葡萄糖 130、玉米浆 30、豆饼水解 液 10、硫酸铵 40、磷酸氢二钾 1、七水合硫酸镁 0.5、碳酸钙 45。用该培养基发酵 72 h，产 酸为 42 g/L，和菌株 FB 21 相比其产酸性能下降很多。 保持高产菌株遗传性能的稳定，防止回复突变，是发酵工业生产中一个非常重要的问题， 目前通常采用的一些方法有： (1)选育遗传性能稳定的菌株：经诱变处理后，在易出现回复突变株的培养基中反复传 代，选出不发生回复突变的菌株。 (2)定向赋加生产菌的遗传标记：如选育双缺菌株，增加抗回复突变性能；对于抗性株， 尽量选育多重抗性突变株
(3)在保藏过程中除选择合理的保藏方法外,对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物, 抗性株可添加适量的抗性物质。 (4)必须定期进行分离、纯化工作,保持其遗传性能的稳定。 通过前面的研究可以发现,虽然FB31是从FB21的保藏斜面中接出,但其遗传标记发 生了改变,比较FB3l和FB2l的发酵性能来看,FB31退化较为明显,主要表现在两方面: 是产酸水平的降低,二是耐高糖性能的降低,表明菌株发生了回复突变。为此对FB31菌 株进行了诱变,希望提高其产酸性能。 四、赖氨酸产生菌FB42的获得 )黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制 根据文献报道,黄色短杆菌产12种氨基酸的合成代谢途径如图4-2-3所示。氨基酸的 代谢途径主要有三条:(1)从葡萄糖经丙酮酸到丙氨酸、缬氨酸:;(2)从葡萄糖经草酰乙酸和 α-酮戊二酸到谷氨酸:(3)从葡萄糖经天门冬氨酸、天门冬氨酸半醛到赖氨酸、苏氨酸和蛋 氨酸 图4-2-3黄色短杆菌氨基酸合成示意图 ①丙酮酸羧化酶:②磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶:③天门冬氨酸激酶:④二氢吡啶二羧酸合成酶:⑤丙酮酸 -L-丙氨酸转移酶:⑥a-酮戊二酸脱羧酶:⑦天门冬氨酸-脱羧酶:⑧高丝氨酸脱羧酶 馈抑制;"反馈阻遏 黄色短杆菌的赖氨酸合成途径,即上述第三条途径,存在着严格的调节机制,正常的细 胞几乎不积累赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。该调节机制由下面几种作用共同完成 ①谷氨酸优先合成,谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶(GD)的活性,使得生物合成的 代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性, 使得天门冬氨酸不致大量积累。 ②赖氨酸的前体物天门冬氨酸与乙酰CoA的生成形成平衡合成( Balance Sythesis。乙酰 CoA的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制 ③天门冬氨酸激酶( Aspartic acid Kinase,AK)受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。研究表明天门 冬氨酸激酶是一个变构酶,该酶催化天门冬氨酸和AP形成α-天门冬氨酸磷酸,有两个 变构位置可以接受末端产物。AK受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制,当只有赖氨酸或苏氨 酸与变构位置结合时,酶活影响不大,当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置上时 酶活受到强烈抑制。此外AK在赖氨酸合成调节中有着重要的意义,研究表明AK是赖 氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。赖氨酸分支途径的其它酶,如第一个专一性酶一 二氢吡啶二羧酸合成酶,末端产物如赖氨酸或其它氨基酸单独或组合对该酶无抑制作 用,且该酶也不受赖氨酸的反馈阻遏 ④赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁( Metabolic Interlock),赖氨酸分支途径 的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏。 ⑤蛋氨酸比苏氨酸优先合成,蛋氨酸合成的过剩就会阻遏高丝氨酸-O转乙酰酶,使得生
8 (3)在保藏过程中除选择合理的保藏方法外，对于营养缺陷型菌株要提供足够的营养物， 抗性株可添加适量的抗性物质。 (4)必须定期进行分离、纯化工作，保持其遗传性能的稳定。 通过前面的研究可以发现，虽然 FB31 是从 FB21 的保藏斜面中接出，但其遗传标记发 生了改变，比较 FB31 和 FB21 的发酵性能来看，FB31 退化较为明显，主要表现在两方面： 一是产酸水平的降低，二是耐高糖性能的降低，表明菌株发生了回复突变。为此对 FB31 菌 株进行了诱变，希望提高其产酸性能。 四、赖氨酸产生菌 FB42 的获得 (一)黄色短杆菌产赖氨酸的合成途径与调控机制 根据文献报道，黄色短杆菌产 12 种氨基酸的合成代谢途径如图 4-2-3 所示。氨基酸的 代谢途径主要有三条：(1)从葡萄糖经丙酮酸到丙氨酸、缬氨酸；(2)从葡萄糖经草酰乙酸和 -酮戊二酸到谷氨酸；(3)从葡萄糖经天门冬氨酸、天门冬氨酸半醛到赖氨酸、苏氨酸和蛋 氨酸。 图 4-2-3 黄色短杆菌氨基酸合成示意图 ①丙酮酸羧化酶；②磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；③天门冬氨酸激酶；④二氢吡啶二羧酸合成酶；⑤丙酮酸 -L-丙氨酸转移酶；⑥-酮戊二酸脱羧酶；⑦天门冬氨酸--脱羧酶；⑧高丝氨酸脱羧酶 反馈抑制； 反馈阻遏 黄色短杆菌的赖氨酸合成途径，即上述第三条途径，存在着严格的调节机制，正常的细 胞几乎不积累赖氨酸、苏氨酸和蛋氨酸。该调节机制由下面几种作用共同完成。 ① 谷氨酸优先合成，谷氨酸合成过剩就会抑制谷氨酸脱氢酶(GD)的活性，使得生物合成的 代谢流转向天门冬氨酸。天门冬氨酸的过剩也会抑制磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性， 使得天门冬氨酸不致大量积累。 ② 赖氨酸的前体物天门冬氨酸与乙酰 CoA 的生成形成平衡合成(Balance Sythesis)。乙酰 CoA 的增加能逆转天门冬氨酸对其自身合成的反馈抑制。 ③ 天门冬氨酸激酶(Aspartic acid Kinase, AK)受赖氨酸与苏氨酸的协同反馈。研究表明天门 冬氨酸激酶是一个变构酶，该酶催化天门冬氨酸和 ATP 形成-天门冬氨酸磷酸，有两个 变构位置可以接受末端产物。AK 受赖氨酸与苏氨酸的协同抑制，当只有赖氨酸或苏氨 酸与变构位置结合时，酶活影响不大，当赖氨酸与苏氨酸同时结合到两个变构位置上时， 酶活受到强烈抑制。此外 AK 在赖氨酸合成调节中有着重要的意义，研究表明 AK 是赖 氨酸合成途径中唯一的反馈调节点。赖氨酸分支途径的其它酶，如第一个专一性酶── 二氢吡啶二羧酸合成酶，末端产物如赖氨酸或其它氨基酸单独或组合对该酶无抑制作 用，且该酶也不受赖氨酸的反馈阻遏。 ④ 赖氨酸与亮氨酸的生物合成之间存在着代谢互锁(Metabolic Interlock)，赖氨酸分支途径 的初始酶二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏。 ⑤ 蛋氨酸比苏氨酸优先合成，蛋氨酸合成的过剩就会阻遏高丝氨酸-O-转乙酰酶，使得生
物合成的代谢流转向苏氨酸。苏氨酸比赖氨酸优先合成,苏氨酸的过剩会反馈抑制高丝 氨酸脱羧酶的活性,使得生物合成转向赖氨酸。 (二)赖氨酸产生菌的育种策略 长期自然选择的结果,使得生存下来的微生物具有严格的代谢调控机制,其胞内的每 步反应速度,以及通过各种途径的代谢流基本平衡,从而能以最经济、有效的方式合成氨基 酸、核酸、脂肪酸、维生素等基础物质,这些物质在体内几乎不积累。发酵工程要求微生物 大量地合成特定的代谢产物,这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达 到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制,使合成产物的途径畅通无阻, 最大限度地积累特定产物,这种发酵称为代谢控制发酵。 结合黄色短杆菌的赖氨酸合成途径和代谢调控机制,相应的育种策略可归纳为 (1)切断代谢支路:选育和应用营养缺陷型菌株,切断丙氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支 途径是积累赖氨酸的有效手段。 (2)解除反馈抑制:选育抗结构类似物的突变株,可以得到对天门冬氨酸激酶反馈抑制 脱敏的菌株,代谢调节被遗传性地解除,这是赖氨酸发酵育种的重要手段。特别是选育营养 缺陷型兼具结枃类似物抗性的突变株,极有希望获得髙产菌株。表4-2-6列举了赖氨酸发酵 育种中曾用过的结构类似物,其中以AEC效果佳、应用广 表4-2-6赖氨酸发酵育种中曾使用过的一些结构类似物 类别 结构类似物名称 使用缩写 赖氨酸结构类似物 S-(2-氨基乙基)-L-半光氨酸 AEC γ-甲基赖氨酸 苯酯基赖氨酸 CBL Q-氯乙内酰氨 CCL a-氟乙内酰氨 F Q-氨基月桂基内酯氨 ALL L-赖氨酸氧肟酸 苏氨酸结构类似物 α-氨基-β-羟基戊酸 AHV 邻甲基苏氨酸 OMI 苏氨酸氧肟酸 ThHx 亮氨酸结构类似物 α-噻唑丙氨酸 a-TA 亮氨酸氧肟酸 LeuHx α-噻唑亮氨酸 a-TL β-羟基亮氨酸 hL 天门冬氨酸结构类似物 天门冬氨酸氧肟酸 AspH 磺氨二甲嘧啶 磺氨胍 SG (3)增加前体物的生物合成:关键酶AK所催化的底物是天门冬氨酸,AK的反应速度与 底物天门冬氨酸浓度之间的关系呈S型,随着天门冬氨酸浓度的增加,AK与天门冬氨酸的 亲和协同性增大。根据变构酶的S型动力学特性,为了提高赖氨酸的产量,应设法增加前 体物质天门冬氨酸的浓度,以抵消变构抑制剂的影响。应此可以考虑选育丙氨酸缺陷型,抗 天门冬氨酸结构类似物的突变株
9 物合成的代谢流转向苏氨酸。苏氨酸比赖氨酸优先合成，苏氨酸的过剩会反馈抑制高丝 氨酸脱羧酶的活性，使得生物合成转向赖氨酸。 (二)赖氨酸产生菌的育种策略 长期自然选择的结果，使得生存下来的微生物具有严格的代谢调控机制，其胞内的每一 步反应速度，以及通过各种途径的代谢流基本平衡，从而能以最经济、有效的方式合成氨基 酸、核酸、脂肪酸、维生素等基础物质，这些物质在体内几乎不积累。发酵工程要求微生物 大量地合成特定的代谢产物，这一目的只有当微生物的部分代谢调控机制遭到破坏时才能达 到。用人工诱变的方法有目的地改变微生物固有的调节机制，使合成产物的途径畅通无阻， 最大限度地积累特定产物，这种发酵称为代谢控制发酵。 结合黄色短杆菌的赖氨酸合成途径和代谢调控机制，相应的育种策略可归纳为： (1)切断代谢支路：选育和应用营养缺陷型菌株，切断丙氨酸、苏氨酸和蛋氨酸的分支 途径是积累赖氨酸的有效手段。 (2)解除反馈抑制：选育抗结构类似物的突变株，可以得到对天门冬氨酸激酶反馈抑制 脱敏的菌株，代谢调节被遗传性地解除，这是赖氨酸发酵育种的重要手段。特别是选育营养 缺陷型兼具结构类似物抗性的突变株，极有希望获得高产菌株。表 4-2-6 列举了赖氨酸发酵 育种中曾用过的结构类似物，其中以 AEC 效果佳、应用广。 表 4-2-6 赖氨酸发酵育种中曾使用过的一些结构类似物 类别 结构类似物名称 使用缩写 赖氨酸结构类似物 S-(2-氨基乙基)-L-半光氨酸 AEC -甲基赖氨酸 ML 苯酯基赖氨酸 CBL -氯乙内酰氨 CCL -氟乙内酰氨 FCL -氨基月桂基内酯氨 ALL L-赖氨酸氧肟酸 LysHx 苏氨酸结构类似物 -氨基--羟基戊酸 AHV 邻甲基苏氨酸 OMT 苏氨酸氧肟酸 ThHx 亮氨酸结构类似物 -噻唑丙氨酸 -TA 亮氨酸氧肟酸 LeuHx -噻唑亮氨酸 -TL -羟基亮氨酸 -HL 天门冬氨酸结构类似物 天门冬氨酸氧肟酸 AspHx 磺氨二甲嘧啶 磺氨胍 SG (3)增加前体物的生物合成：关键酶 AK 所催化的底物是天门冬氨酸，AK 的反应速度与 底物天门冬氨酸浓度之间的关系呈 S 型，随着天门冬氨酸浓度的增加，AK 与天门冬氨酸的 亲和协同性增大。根据变构酶的 S 型动力学特性，为了提高赖氨酸的产量，应设法增加前 体物质天门冬氨酸的浓度，以抵消变构抑制剂的影响。应此可以考虑选育丙氨酸缺陷型，抗 天门冬氨酸结构类似物的突变株