GB/T5750.12-2006 表1（续） 不可稀释度的平均菌落数 丽个稀程度 腹落范数 实创 报告方式/(CU/mL) 10-1 10-2 10-3 菌落数之比(CU/mL》 多不可计 1650 513 513000 510000或5.1×10' 29 11 270 270或2.7×10 7 多不可计 305 12 30500 31000或3.1×10 2总大肠群 2.1多管发酵法 2.1.1范围 本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。 本法适用于生活伙用水及其水源水中总大肠菌群的测定。 2.1.2术语和定义 下列术语和定义适用于本标准 2.1.2.1 总大肠苗群total coliforms 总大肠菌群指一群在37℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢 杆菌。 2.1.3培养基与试剂 2.1.3.1乳糖蛋白陈培养液 2.1.3.1.1成分 A蛋白陈 10g B牛肉膏 3 g C到糖 D氯化钠 5 g E溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1 mL F蒸馏水 1000mL 2.1.3.1.2制法 将蛋白胨、牛肉膏，乳及氯化钠溶于馏水中，调整pH为7.2~7.4，再加人1mL16g/L的澳甲 阶紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa(115℃，10Ib)高压灭菌20min,贮存于 冷暗处备用。 21,3.2二倍浓缩乳糖蛋白陈培养液 按上述乳精蛋白陈培养液(2.1.3.1)，除蒸馏水外，其他成分量加倍。 2.1.3.3伊红美蓝培养基 2.1.3.3.1成分 10g 10g C磷酸氢二钾 2g D琼脂 20g~30g 任森服的心 1000ml 20mL
GB/T5750.12-2006 G类蓝水溶液(5g/L) 13 mL 2.1.3.3.2制法 将蛋白胨，瞬酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kP (115℃，101b)高压灭菌20min,临用时加热融化琼脂，冷至50℃~55℃，加入伊红和美蓝溶液，混匀， 倾注平皿 2.1.3.4革兰氏染色液 2.1.3.4.1结品紫染色液 A成分 结晶紫 18 b乙醇(95%，体积分数) 20 mL c草酸铵水溶液(10g/L) 80 mL B制法：将结品紫溶于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 注：结品紫不可用龙胆紫代，者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性。结品紫溶液敢置过久会产生沉淀， A成分： 】g b碘化钾 2g c蒸馏水 300mL B制法：将碘和碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。 2.1.3.4.3脱色剂 乙醇(95%，体积分数) 2.1.3.4.4沙黄复染液 A成分， a沙黄 0.25g b乙醇(95%，体积分数 10 mL c蒸馏水 90 mL B制法：将沙黄溶解于乙醇中，待完全溶解后加人蒸馏水。 2.1.3.4.5染色法 A将培养18h~24h的培养物涂片 B将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1mi,水洗。 C滴加革兰氏碘液，作用1min,水洗。 D滴加脱色剂，摇动玻片，直至无紫色脱落为止，约305，水洗 E滴加复染剂，复染1min,水洗，待干，镜检 2.1.4仪器 21.4.1挤浆箱，36℃+1℃ 2.1.4.2 冰箱：0℃一4℃. 2.1.4.3天平。 2.1.4.4显微镜. 2.1.4.5平m:直径为9cm 2.1.4.6 试管 2.1.4.7分度吸管：1mL,10mL。 4
GB/T5750.12-2006 2.1.4.8形瓶 2.1.4.9小倒管 2.1.4.10载玻片 2.1.5检验步 2.1.5.1乳糖发酵试验 2.1.5.1.1取10mL水样接种到10mL双料乳糖蛋白胨培养液中，取1mL水样接种到10mL单料 乳糖蛋白陈培养液中，另取1mL水样注人到9mL灭菌生理盐水中，混匀后吸取1mL(即0.1mL水 样)注入到10mL单料乳糖蛋白陈培养液中，每一稀释度接种5管。 对已处理过的出厂自来水，需经常检验或每天检验一次的，可直接种5份10mL水样双料培养基， 每份接种10mL水样。 2.1.5.1.2检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1,0.1,0.01mL甚至0.1,0.01 0.001mL,每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1mL以下水样时，必须作10倍递增稀 释后，取1mL接种，每递增稀释一次，换用1支1mL灭菌刻度吸管 2.1.5.1.3将接种管置36℃士1℃培养箱内，培养24h士2h,如所有乳糖蛋白陈培养管都不产气产 酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。 2.1.5.2分离培养 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，于36℃士1℃培养箱内培养18h~24h,观察 菌落形态，挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。 深紫黑色、具有金属光泽的菌落； 紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落： 淡紫红色、中心较深的菌落。 2.1.5.3证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖蛋白胨培养液，置36℃士1℃培养箱中培 养24h土2h,有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。 2.1.6结果报告 根据证实为总大肠菌群阳性的管数，查MPN(most probable number,最可能数)检索表，报告每 100mL水样中的总大肠南群最可能数(MPN)值。5管法结果见表2,15管法结果见表3。稀释样品查 表后所得结果应乘稀释倍数。如所有乳糖发酵管均阴性时，可报告总大肠菌群未检出。 表2用5份10mL水样时各种阳性和阴性结果组合时的最可能数(MPN) 5个10mL管中阳性管数 最可能数(MPN) 0 <2.2 1 2.2 2 5.1 3 9.2 16.0 >16
GB/T5750.12-2006 表3总大肠菌群MPN检索表 (总接种量55.5mL,其中5份10mL水样，5份1mL水样，5份0.1mL水样) 接种量/mL 总大肠菌群 接种量/mL 总大肠菌卧 10 1 0.1 (MPN/100 mL 10 1 0.1 (MPN/100 mL) 0 <2 0 0 0 0 2 0 1 0 0 0 0 0 10 0 0 12 1 0 4 1 0 1 1 2 1 3 3 9 1 11 0 1 1 5 14 0 2 4 1 2 0 6 12 2 10 0 1 2 3 0 9 4 5 13 2 5 1 0 0 6 1 3 0 8 0 7 1 3 10 3 23 9 3 12 11 15 3 17 0 3 1 19 0 4 0 4 89 1 13 0 1 0 73 1 3 : 5 1 4 4 79 0 5 1 4 22 0 5 0 9 1 13 0 5 113 15 2 0 3 19 0 17 19 24
GB/T5750.12-2006 表3（续） 接种量/mL 总大肠菌群/ 接种盘/mL 总大肠菌群/ 10 1 0.1 (MPN/100 mL) 0.1 (MPN/100 mL) 2 0 0 0 0 0 12 20 23 1 3 0 14 12 14 20 17 2 9 2 1 3 2 22 2 3 12 3 3 公 14 3 2 17 20 4 3 16 4 0 15 2 17 02 3 3 25 g 0 17 3 5 25 2 2 32 37 2 5 29 32