p1000移液器量程201~1,000μL口500μL窗口读数5Lop200移液器量程21~200μL口150uL窗口读数国Lp20移液器量程2~20μL口E12uL窗口读数Lop2移液器量程0.5~2uL口1μL窗口读数[0（二）移液器的使用1.设定移液体积，根据吸取液体的体积，选择适当的移液器。在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可：但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。2.枪头的装配将移液器垂直插入微量移液器枪头（tip)中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合，上紧即可。P1000使用蓝色微量移液器头，P200及P20使用黄色微量移液器头，P2使用白色微量移液器头
p1000 移液器 量程 201 ~ 1,000µL 500µL 窗口读数 p200 移液器 量程 21 ~ 200µL 150µL 窗口读数 p20 移液器 量程 2 ~ 20µL 12µL 窗口读数 p2 移液器 量程 0.5 ~ 2µL 1µL 窗口读数 （二）移液器的使用 1. 设定移液体积， 根据吸取液体的体积，选择适当的移液器。 在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋 转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量 程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。 2. 枪 头的装配 将移液器垂直插入微量移液器枪头 (tip)中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密 结合，上紧即可。 P1000 使用蓝色微量移液器头，P200 及 P20 使用黄色微量移液器头，P2 使用白色微 量移液器头。 0 5 0 1 5 0 1 2 0 1 0 0
严禁移液器撞击枪头，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，长期这样操作会导致移液器的零件损坏。3.移液的方法吸取液体时，移液器保持竖直状态（角度控制在倾斜20度之内），将枪头插入液面下。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。这时可以采取两种移液方法。一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有残留液体的枪头，弃之。吸液速度：移液操作应保持平顺、合适的吸液速度：过快的吸液速度容易造成样品进入套柄，带来活塞和密封圈的损伤以及样品的交叉污染。4.枪头浸入深度建议如下所示：移液器规格吸头浸入深度1 mm2μL和10μL20μL和100μL2-3 mm200μL和1000μL3-6 mm5.移液器的正确放置使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来
严禁移液器撞击枪头，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的 瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，长期这样操作会导致移液器的 零件损坏。 3. 移 液的方法 吸取液体时，移液器保持竖直状态（角度控制在倾斜 20 度之内），将枪头插入液 面下。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与 水不同的液体时）。 这时可以采取两种移液方法。 一 是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。 接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。 最后松开按钮。 二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极 微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余 的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排 出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有 残留液体的枪头，弃之。 吸 液速度：移液操作应保持平顺、合适的吸液速度；过快的吸液速度容易造成 样品进入套柄，带来活塞和密封圈的损伤以及样品的交叉污染。 4. 枪头浸入深度建议如下所示： 移液器规格 吸头浸入深度 2µL 和 10 µL 1 mm 20µL 和 100 µL 2-3 mm 200µL 和 1000 µL 3-6 mm 5. 移 液器的正确放置 使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来
五、注意事项1.如不使用，要把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。2.套有微量移液器头的微量移液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。3.吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干净，擦干后再正确组合回复原状。4.若不小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱等各部位以清水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状5.定期自行以天平检查准确度，若有任何问题请送厂维修。六、思考题1、如果移液器移液体积不准确，可能是什么原因，该如何维护？
五 、注意事项 1. 如不使用，要把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。 2. 套有微量移液器头的微量移液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放， 需直立架好。 3. 吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干 净，擦干后再正确组合回复原状。 4. 若不小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱等各部位以清 水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状。 5. 定期自行以天平检查准确度，若有任何问题请送厂维修。 六 、思考题 1、如果移液器移液体积不准确，可能是什么原因，该如何维护？
实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化一、实验目的通过本实验学习和掌握DNA的限制性内切酶酶切原理及技术。二、实验原理Ⅱ类限制性内切核酸酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA的基础。I类限制酶识别长度为4至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRI识别六个核苷酸序列:5-GIAATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段：切割双链DNA产生3种不同的切口一一平末端（如SmaI：5'CCCIGGG-3)，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性未端，包括5端突出：3端突出。如EcoRI切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。+5'GAATTC3'5'G3'5'AATTC3'?3'CTTAAG53'G5'3'CTTAA51三、实验材料、仪器和试剂（一）仪器恒温培养箱/恒温水浴、台式离心机、高压灭菌锅、移液器。（二）材料含有GFP的克隆载体（质粒）pUC119-GFP、原核表达载体pET-22b（质粒图谱见图2.1）无菌吸头和微量离心管。EcORIHindlllEcoRISac!SallHind i3...GATTCaATG...TAGAAG CTT...5'.CCGAACGTCGACAAGAspErash serserse ValAsrLysLeGFPPT711bpOiacpelB6xHisLeaderAmpAmppUC119-GFPpET-22b(+)(3860 bp)(5493bp)OriOri图2.1pUC119-GFP与pET-22b质粒的图谱
实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化 一 、实验目的 通过本实验学习和掌握 DNA 的限制性内切酶酶切原理及技术。 二 、实验原理 Ⅱ类限制性内切核酸酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组 DNA 的基础。Ⅱ类 限制酶识别长度为 4 至 6 个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如 EcoRⅠ识别六个核苷酸 序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列，并在这个顺序内进行切割， 产生特异的 DNA 片段；切割双链 DNA 产生 3 种不同的切口－－平末端(如 SmaⅠ:5'- CCC↓GGG-3')，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的 DNA 片段称粘性未 端,包括 5’端突出；3’端突出。 如 EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 三 、实验材料、仪器和试剂 （一）仪器 恒温培养箱/恒温水浴、台式离心机、高压灭菌锅、移液器。 （二） 材料 含有 GFP 的克隆载体（质粒）pUC1l9-GFP、原核表达载体 pET-22b（质粒图谱见图 2.1）； 无菌吸头和微量离心管。 图 2.1 pUC1l9-GFP 与 pET-22b 质粒的图谱
（三）试剂限制性内切酶EcoRI（10units/μL）、HindIII（10units/μL）、10x酶切反应缓冲液。四、实验方法及步骤取质粒DNA1μg，加3μL10x酶切缓冲液，EcoRI和HindIII酶各1μL，无菌水补至总体积30μL，轻缓吹吸混匀，37℃培养箱或恒温水浴保温3h。五、注意事项[注意]1.酶解反应完成后，如不能及时进行下一步操作，酶解液需冷冻保存（-20℃）。2．当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要使用新的吸管头。3.如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1倍体积3mol/LNaAc和2倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。4.内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μgDNA加1单位酶，消化1-2小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，反应时间也要适当延长。六、思考题1、通过PCR手段获得目的基因，如何在目的基因上添加酶切位点？
（三） 试剂 限制性内切酶 EcoRI（10 units/µL）、Hind III（10 units/µL）、10x 酶切反应缓冲液。 四 、实验方法及步骤 取质粒 DNA 1µg，加 3µL 10x 酶切缓冲液，EcoRI 和 Hind III 酶各 1 µL, 无菌水补至 总体积 30µL，轻缓吹吸混匀，37℃培养箱或恒温水浴保温 3 h。 五 、注意事项 [注意] 1. 酶解反应完成后，如不能及时进行下一步操作，酶解液需冷冻保存（-200C）。 2. 当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取 限制性内切酶时，每次都要使用新的吸管头。 3. 如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用 同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使 用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后， 用等体积酚/氯仿抽提，加 0.1 倍体积 3mol/L NaAc 和 2 倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃ 低温冰箱 30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。 4. 内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温 度(大多数为 37℃)。对质粒 DNA 酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系 1μg DNA 加 1 单位酶，消化 1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，反应时间也要适当延长。 六 、思考题 1、通过 PCR 手段获得目的基因，如何在目的基因上添加酶切位点？