吉社11pET-28a(+)载体iXho (158)Not l(166)Eag l(166)pET-28a(+) sequence landmarksHindl(173)T7promoter370-386Sal I(179)Sac l(190)369T7transcriptionstartECORI(192)270-287His·Tag coding sequenceBamHI(198)Nhel(231)207-239T7-TagcodingsequenceBpu1102I(80)Ndel(238)Multiple cloning sitesDrall(5127)Nco(296)Xbal(335)(BamHI-Xho))158-203Bql I(401)140-157His·Tag coding sequence1origin(4903-5358)SgrAl(442)26-72T7terminatorSphI(598)773-1852lacl coding sequence3286pBR322originKan (3995-4807)3995-4807Kan coding sequencePvu I(4426)Sgf(4426)4903-5358floriginSma l(4300)Mlul(1123)ThemapsforpET-28b(+)andpET-28c(+)lacl (773-1852)Bcl(1137)arethesameaspET-28a(+)(shown)withClal(4117)thefollowingexceptions:pET-28b(+)isaBstEIl(1304)Nrul(4083)5368bpplasmid;subtract1bpfromeachsitepET-28a(+)Apal(1334)beyondBamHIat198.pET-28c(+)isa(5369bp)5367bpplasmid;subtract2bpfromeachsite/BsSH Il(1534)beyondBamHIat198.Eco57 I(3772)ECORV(1573)Hpal(1629)AlwN I(3640)ori(328PshAI(1968)6BssSl(3397)BglI(2187)BSpLU11(3224)Sapl(3108)FspI(2205)Bst1107((2995)Psp5Il(2230)Tth111l(2969)
pET-28a(+) 载体 7
大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性是迄今为止研究得最详尽的原核生物。S已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥有各种宿主菌和载体。S培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于进行工业化批量生产。S许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素黏基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达
大肠杆菌作为基因工程宿主菌的优越性 § 是迄今为止研究得最详尽的原核生物。 § 已被发展成为一种安全的基因工程实验体系，拥 有各种宿主菌和载体。 § 培养简单，繁殖迅速，培养代谢易于控制，易于 进行工业化批量生产。 § 许多克隆的真核基因，如生长激素基因和胰岛素 基因等，都可在大肠杆菌中实现高效表达
11局限性11S不具备真核生物的蛋白质复性系统；1.11S缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统：1招蒙111造S内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，1/1成表达产物不稳定1111稻直E1E1111111[111111111意11111
局 限 性 § 不具备真核生物的蛋白质复性系统； § 缺乏真核生物蛋白质加工修饰系统； § 内源蛋白酶易降解空间构象不正确的异源蛋白，造 成表达产物不稳定
第二节克隆基因的表达表达策略：高效表达，此涉及增加载体的拷贝数和促进克隆基因的正确表达台1福图1-3pBV220的物理图谱表达大量蛋白的细胞比野生型细胞生长缓慢，使用可诱导启动子EcoRI,Smal,BamHl,Sall,Hincll,Rtl,Hindill有助于避免这一问题XmmlBglll11PLtIImBT112PRSspl-Xmnl表达的蛋白有毒性，构建分泌载HindillpBV220-HincllScal体(secretion vector)。分泌对细胞HindillCIts857-AmpHincllPvul3666bp的存活有利；分泌有利于蛋白纯化。Bgllorit1111减
第二节 克隆基因的表达 表达策略：高效表达，此涉及增加载体的拷贝数和促进克隆 基因的正确表达。 表达大量蛋白的细胞比野生型细 胞生长缓慢，使用可诱导启动子 有助于避免这一问题。 表达的蛋白有毒性，构建分泌载 体(secretion vector)。分泌对细胞 的存活有利；分泌有利于蛋白纯 化
u外源基因在原核细胞中表达的调节元件(1)常采用的启动子11①Lac启动子：111111无CAP-S突变的Lac启动子对分解代谢抑制不敏感，cAMP时也照常转录。S异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产量增加50倍S构建含有两个连续的Lac启动子载体，阻遏蛋白阻遏不完全，提高表达水平。1111111111111
外源基因在原核细胞中表达的 调节元件 (1)常采用的启动子 ①Lac启动子： § 突变的Lac启动子对分解代谢抑制不敏感，无CAPcAMP时也照常转录。 § 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产量增加50倍。 § 构建含有两个连续的Lac启动子载体，阻遏蛋白阻 遏不完全，提高表达水平