2.溶剂： 90-95%乙醇500ml,80%乙醇200ml,乙醚500ml,CHCl3,Me0H各50~ 100ml。 3.试剂： HCl,NaHCO3,Na2CO3,NaOH,无水硫酸钠，活性炭(2g),AlO3(30g), 硅胶G。 4.展开剂： (1)石油醚(bp3060℃)-甲酸乙酯-甲酸(15：5：1，上层)15m1。 (2)氯仿-甲醇(9：2) 5.显色剂 (1)5%KOH/MeOH液 (2)1%FeCl3-1%铁氰化钾（1：1) 6.定性试剂 2%NaOH,0.5%Mg (Ac)2 六、实验方法 1.乙醇总提取物的制备 取虎杖粗粉50g,用90~95%乙醇回流提取二次(200ml1h:150ml1h),过 滤合并乙醇液，如有沉淀，抽滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，得乙醇总提取物。 2.总游离蒽醌的提取 将上述提取物，加入15ml水稀释至分液漏斗中，用乙醚萃取(25ml×2, 20m×4),合并乙醚液即为总游离蒽醌。乙醚萃取后的水层含有水溶性成分。 3.游离蒽醌得分离 (1)大黄素的分离 上述乙醚液移至分液漏斗中，用5%NaHCO3水溶液萃取3~4次(20ml×2, 15ml×1~2),弃去NaHCO3液。乙醚溶液再用5%NaCO3水溶液萃取7~9次 (25ml×2,20ml×2~3,15ml×3~4)。合并Na2CO3萃取液，挥去碱液中的乙 瞇，碱液在搅拌下慢慢滴加6NHCI调PH=2,稍放置，抽滤，沉淀水洗至中性， 干燥，称重。沉淀物用20ml环己烷-丙酮(7：3)溶解后，经硅胶柱层析(15g)
9 2. 溶剂： 90-95%乙醇 500ml，80%乙醇 200ml，乙醚 500ml，CHCl3，MeOH 各 50～ 100ml。 3. 试剂： HCl，NaHCO3，Na2CO3，NaOH，无水硫酸钠，活性炭（2g），Al2O3（30g）， 硅胶 G。 4. 展开剂： （1）石油醚（bp30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15:5:1，上层）15ml。 （2）氯仿-甲醇（9:2） 5. 显色剂 （1）5%KOH/MeOH 液 （2）1%FeCl3-1%铁氰化钾（1:1） 6. 定性试剂 2%NaOH，0.5%Mg（Ac）2 六、实验方法 1．乙醇总提取物的制备 取虎杖粗粉 50g，用 90～95%乙醇回流提取二次（200ml 1h；150ml 1h），过 滤合并乙醇液，如有沉淀，抽滤，滤液减压回收乙醇至无醇味，得乙醇总提取物。 2．总游离蒽醌的提取 将上述提取物，加入 15ml 水稀释至分液漏斗中，用乙醚萃取（25ml×2， 20ml×4），合并乙醚液即为总游离蒽醌。乙醚萃取后的水层含有水溶性成分。 3．游离蒽醌得分离 （1）大黄素的分离 上述乙醚液移至分液漏斗中，用 5%NaHCO3 水溶液萃取 3～4 次（20ml×2， 15ml×1～2），弃去 NaHCO3 液。乙醚溶液再用 5%Na2CO3 水溶液萃取 7～9 次 （25ml×2，20ml×2～3，15ml×3～4）。合并 Na2CO3 萃取液，挥去碱液中的乙 醚，碱液在搅拌下慢慢滴加 6NHCl 调 PH=2，稍放置，抽滤，沉淀水洗至中性， 干燥，称重。沉淀物用 20ml 环己烷-丙酮（7:3）溶解后，经硅胶柱层析（15g）
环己烷-丙酮(7：3)洗脱，流速约4~5ml/min,洗脱至橙色色带洗下即可，收集 洗脱液，回收溶剂至干，残留物加少量乙醇溶解，得大黄素乙醇液。 (2)大黄素-6-甲醚的分离 以上用Na2CO,萃取过的乙醚溶液再用2%NaOH水溶液萃取4~5次，每次 10ml,合并NaOH液，干燥、挥去碱液中的乙醚，碱液在搅拌下慢慢滴加6NHCI 调PH=2,稍放置，抽滤，沉淀水洗至中性，干燥，称重，得大黄素-6-甲瞇粗品。 (3)中性脂溶性成分的分离 上述NaOH萃取过的乙醚液，用水洗至中性，再用无水Na2SO4脱水，回收 乙醚得残留物，即得中性脂溶性成分。 4.白藜芦醇苷的分离： 取“2”中乙醚萃取过的水层，挥去乙醚，置烧杯中加水至150ml,搅拌混 合后，加热10min,放冷过滤，滤液加活性炭2g,煮沸20分钟，趁热过滤，滤 液放冷后置分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取5~7次(40×2~3,30×3~4)，合并 乙酸乙酯萃取液回收溶剂，残留物用适量80%乙醇溶解，经A2O3柱层析（中性 A2O3100~200目，装柱15cm,柱径2cm,干法装柱)净化，80%乙醇洗脱（约 100ml),洗脱液回收至干，加1ml水及5ml乙醇，加热溶解（需要过滤时须趁 热过滤)。滤液放置，析晶，鉴识。 5.鉴识 A.层析法鉴定： (1)游离蒽醌的硅胶GTLC 对照品：大黄素、大黄素甲醚 样品：自制大黄素、大黄素甲醚乙醇液 展开剂：石油醚(bp30~60℃)一甲酸乙酯一甲酸(15：5：1)，上层。 显色剂：a.紫外灯下观察荧光 b.5%KOH甲醇溶液 (2)白藜芦醇苷的硅胶GTLC 对照品：白藜芦醇苷 样品：自制白藜芦醇苷乙醇液 展开剂：CHCl3-MeOH(9:2) 10
10 环己烷-丙酮（7:3）洗脱，流速约 4～5ml/min，洗脱至橙色色带洗下即可，收集 洗脱液，回收溶剂至干，残留物加少量乙醇溶解，得大黄素乙醇液。 （2）大黄素-6-甲醚的分离 以上用 Na2CO3 萃取过的乙醚溶液再用 2%NaOH 水溶液萃取 4～5 次，每次 10ml，合并 NaOH 液，干燥、挥去碱液中的乙醚，碱液在搅拌下慢慢滴加 6NHCl 调 PH=2，稍放置，抽滤，沉淀水洗至中性，干燥，称重，得大黄素-6-甲醚粗品。 （3）中性脂溶性成分的分离 上述 NaOH 萃取过的乙醚液，用水洗至中性，再用无水 Na2SO4 脱水，回收 乙醚得残留物，即得中性脂溶性成分。 4．白藜芦醇苷的分离： 取“2”中乙醚萃取过的水层，挥去乙醚，置烧杯中加水至 150ml，搅拌混 合后，加热 10min，放冷过滤，滤液加活性炭 2g，煮沸 20 分钟，趁热过滤，滤 液放冷后置分液漏斗中，用乙酸乙酯萃取 5～7 次（40×2～3，30×3～4），合并 乙酸乙酯萃取液回收溶剂，残留物用适量 80%乙醇溶解，经 Al2O3 柱层析（中性 Al2O3100～200 目，装柱 15cm，柱径 2cm，干法装柱）净化，80%乙醇洗脱（约 100ml），洗脱液回收至干，加 1ml 水及 5ml 乙醇，加热溶解（需要过滤时须趁 热过滤）。滤液放置，析晶，鉴识。 5．鉴识 A．层析法鉴定： （1）游离蒽醌的硅胶 G TLC 对照品：大黄素、大黄素甲醚 样 品：自制大黄素、大黄素甲醚乙醇液 展开剂：石油醚(bp30～60℃)—甲酸乙酯—甲酸（15:5:1），上层。 显色剂：a.紫外灯下观察荧光 b.5%KOH 甲醇溶液 （2）白藜芦醇苷的硅胶 G TLC 对照品：白藜芦醇苷 样 品：自制白藜芦醇苷乙醇液 展开剂：CHCl3-MeOH（9:2）
显色剂：a.紫外灯(365nm)下观察荧光 b.5%KOH甲醇溶液 B.定性反应一游离蒽醌的反应 分别取大黄素、大黄素甲醚少许，乙醇2ml溶解，做如下反应： a:Borntrager反应：取试液lml,滴加2%NaOH溶液，观察颜色。 b:Mg(Ac)2试剂：取试液lml,滴加5%Mg(Ac2溶液2一3滴，观察颜色。 七、实验安排 本试验共分4.5次完成。 第一次：乙醇总提取物的制备 第二次：总游离蒽醌的提取；游离蒽醌的分离 第三次：白藜芦醇苷的分离（开始至“残留物用适量80%乙醇溶解”）：大黄 素的重结晶 第四次：白藜芦醇苷的分离（残留物乙醇液经A2O3柱净化至放置结析晶）： 大黄素结晶的过滤、洗涤、称重：定性反应：层析板的涂铺(2块) 第五次：游离蒽醌、白藜芦醇苷的层析鉴识；（实验二芦丁的提取） 八、思考题 1.pH梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中草药成分的分离？ 2.根据薄层色谱结果分析各蒽醌类成分的结构与Rf值的关系。 3.试说明各显色反应机制。 4.试总结萃取操作程序及注意事项。 5.结晶及重结晶操作的关键步骤是什么。 6.过滤方式有几种？怎样选用？ 7.活性碳脱色在什么溶剂中效率最高？ 8.本试验中，在水与亲脂性有机溶剂萃取前，为什麽水液必须浓缩至无醇 味。 11
11 显色剂：a.紫外灯（365nm）下观察荧光 b.5%KOH 甲醇溶液 B．定性反应—游离蒽醌的反应 分别取大黄素、大黄素甲醚少许，乙醇 2ml 溶解，做如下反应： a：Borntrager 反应：取试液 1ml，滴加 2%NaOH 溶液，观察颜色。 b：Mg(Ac)2 试剂：取试液 1ml，滴加 5% Mg(Ac)2 溶液 2—3 滴，观察颜色。 七、实验安排 本试验共分 4.5 次完成。 第一次：乙醇总提取物的制备 第二次：总游离蒽醌的提取；游离蒽醌的分离 第三次：白藜芦醇苷的分离（开始至“残留物用适量 80%乙醇溶解”）；大黄 素的重结晶 第四次：白藜芦醇苷的分离（残留物乙醇液经 Al2O3 柱净化至放置结析晶）； 大黄素结晶的过滤、洗涤、称重；定性反应；层析板的涂铺（2 块） 第五次：游离蒽醌、白藜芦醇苷的层析鉴识；（实验二芦丁的提取） 八、思考题 1．pH 梯度萃取法的原理是什么？适用于哪些中草药成分的分离？ 2．根据薄层色谱结果分析各蒽醌类成分的结构与 Rf 值的关系。 3．试说明各显色反应机制。 4．试总结萃取操作程序及注意事项。 5．结晶及重结晶操作的关键步骤是什么。 6．过滤方式有几种？怎样选用? 7．活性碳脱色在什么溶剂中效率最高？ 8．本试验中，在水与亲脂性有机溶剂萃取前，为什麽水液必须浓缩至无醇 味
实验二槐花米黄酮苷及苷元的提取和鉴定 槐花米系豆科槐属植物(Sophora japonica.L)的花蕾。历来作为止血药物治 疗痔、子宫出血、吐血、鼻衄等。其所含主要成分为芦丁(Rutin,.亦称芸香苷)， 其含量高达12~16%。药理试验证明芦丁有调节毛细血管渗透作用，临床用于治 疗毛细血管性止血药，作为高血压症的辅助药物。 芦丁广泛存在于植物中，现已发现含芦丁的植物达70种以上。 一、主要黄酮类成分的物理性质 (1)芦丁（芸香苷，Rutin) OH HO OH O-glu-O-rha OH 淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物174℃一178℃；无水物为188℃。 芦丁溶解度见下表： 水 甲醇 乙醇 吡啶 冷 0.0043 1.0 0.36 8.5 热 0.55 11.2 3.5 易溶 不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙脂、丙酮等溶剂。易溶于碱液且呈黄色， 酸化后复析出。可溶于浓硫酸和浓盐酸且呈棕黄色，加水稀释复又析出。 UV:2onm(1ogε)259,266sh,299sh,359 (2)槲皮素(Quercetin):
12 实验二 槐花米黄酮苷及苷元的提取和鉴定 槐花米系豆科槐属植物（Sophora japonica. L）的花蕾。历来作为止血药物治 疗痔、子宫出血、吐血、鼻衄等。其所含主要成分为芦丁（Rutin，亦称芸香苷）， 其含量高达 12～16%。药理试验证明芦丁有调节毛细血管渗透作用，临床用于治 疗毛细血管性止血药，作为高血压症的辅助药物。 芦丁广泛存在于植物中，现已发现含芦丁的植物达 70 种以上。 一、主要黄酮类成分的物理性质 （1）芦丁（芸香苷，Rutin） HO O OH O O-glu-O-rha OH OH 淡黄色针状结晶，熔点：含三分子结晶水物 174℃—178℃；无水物为 188℃。 芦丁溶解度见下表： 水 甲醇 乙醇 吡啶 冷 0.0043 1.0 0.36 8.5 热 0.55 11.2 3.5 易溶 不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙脂、丙酮等溶剂。易溶于碱液且呈黄色， 酸化后复析出。可溶于浓硫酸和浓盐酸且呈棕黄色，加水稀释复又析出。 UV：λ MeOH max nm（logε）259，266sh，299sh，359 (2)槲皮素（Quercetin）：