《病毒学报》：人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展（厦门大学）

第34卷第2期 病毒学报 2018年3月 CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY March 2018 人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 史晶洁,宋硕1,王大宁2,李智海1,夏宁邵12,李少伟1,2 (1.厦门大学国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心生命科学学院,厦门361102 2.厦门大学分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室公共卫生学院,厦门361102) 摘要:病毒样颗粒( Virus- like particles,VLPs)作为一种形态结构与真病毒高度相似的空心颗粒,具有真病毒类似 特性,在机体内能刺激免疫系统产生高滴度的中和抗体,又因为其缺乏核酸无法复制,近年来一直被作为理想的候 选疫苗蛋白。目前上市的三种人类乳头瘤病毒( Human papillomavirus,HPV)疫苗都是属于基因工程VLP疫苗 对于HPⅤⅥLP组装的研究能够更好的为疫苗研发方面提供更多的优化手段。该文旨在总结这十几年人乳头瘤 病毒ⅥLP组装的研究进展,为HPⅤ以及其它病毒的基因工程疫苗研发提供更多有价值的信息,为人类健康作出 贡献 关键词:人乳头瘤病毒(HPV);主要衣壳蛋白L1;病毒样颗粒(VLPs);疫苗;组装 中图分类号:R3739文献标识码:A文章编号:1000-8721(2018)02-0252-07 DOI: 10.13242/j cnki. bingduxuebao. 003329 全球每年新发癌症病例中5%是由人乳头瘤病LCR)。晚期基因区(L区)长度3000bp左右,编码 毒引发的癌症(包括女性宫颈癌、阴道癌、男性阴茎2个病毒衣壳蛋白,即病毒主要衣壳蛋白L1和次要 癌等),其中宫颈癌病例占据女性恶性肿瘤疾病第二衣壳蛋白L2。其中基因长约1.5kb的L1衣壳蛋白 位。据WHO世界卫生组织2012年癌症数据统计,是HPV衣壳蛋白的主要成份,蛋白表观分子量为 全球每年宫颈癌新生病例达528万,且每年死亡病50~60kD,占病毒衣壳蛋白总量的80%~90% 例高达266万。我国每年有近10万名女性被两种蛋白共同构成病毒的衣壳结构,与病毒入胞密 诊断出宫颈癌,且发病越来越趋于年轻化,其中切相关 99.7%都是由于HPV感染所引起的,所以,HPV 1991年 Frazer等人发现,HPV的L1蛋白可以 的研究刻不容缓。 在体外培养表达。该蛋白在一定条件下可以自发组 人类乳头瘤病毒属乳头瘤病毒科(papoτaτiri 装为与病毒颗粒结构高度一致的VLP。其由72个 dac)乳头瘤病毒属。乳头瘤病毒能感染人和多种高壳粒以T=7的二十面体形式组装而成。且每个壳 级脊椎动物如兔、牛、狗等的皮肤粘膜,诱导产生上粒都是由5个主要衣壳蛋白L1单体聚合形成五聚 皮组织的疣状增生乃至良恶性肿瘤。但由于乳头瘤体。另外, Chen X S等人在2001年解析出 病毒的感染具有严格的宿主特异性,传统的病毒学 HPV16L1T=1的三维结构,表明HPVL1在 研究难以开展。直到19世纪70年代基因测序技术 定条件下也可组装成12个壳粒的T=1的二十面 的发展,它们与各种粘膜疾病的关系才被研究清楚 体的“小VLP”。随后2010年 Wolf m等人解析 HPV基因组由闭合环状双链DNA分子构成 了 BPV VLP T=7的三维结构,揭示了L1蛋白的 不同型别间基因组长度不同,大小约7.2~8kb,包 含有8个开放阅读框,编码6个早期蛋白和2个晚结构基础,是HPV结构研究的重大突破 期蛋白,以及1个长调控区( Long control region, 研究表明,VLP保留了与真病毒颗粒相似的构 象且具有近乎相同的中和表位,进入机体后能够激 收稿日期:2017-1030;修回日期:2017-12-19 发体内相应的免疫应答,预防HPV病毒的入侵,且 基金项目:国家自然科学基金(项目号:31670935),题目:不同VLP不需要包裹遗传物质DNA不具有相应的复制 型别五聚体杂合的人乳头瘤病毒样颗粒的组装机制和型交叉免疫原 性的研究;国家自然科学基金(项目号:817016537),题目:人乳头瘤能力,已被作为一种主流的HPV疫苗形式[1 病毒16、31、33和58型别交叉中和表位的特征和初步定位;福建省 目前,上市的HPⅤ预防性疫苗主要包括默克 自然科学基金(项目号:2017J07005),题目:戊型肝炎病毒中和作用 公司的 gardasil和史克公司的 Cervarix”。它们通 和抗体间协同作用的机制及结构基础 作者简介:史品洁(192),女,陕西西安人,硕士研究生,生物学过真核表达系统制备相应的VLP。而国内由本实 专业,主要从事HPⅤ病毒研究工作,E-mail:329426420@qq.con 验室夏宁邵老师团队自主研发的原核系统表达的 本通讯作者:李少伟(1976),博士生导师,教投,主要从事分子HPV16/18(宫颈癌疫苗)目前正处在Ⅲ期临床试验 病毒学研究,E- mail, shaowei xmu.edu.cn 阶段,HPV6/11(尖锐湿疣疫苗)也处于Ⅱ期临床试 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

第３４卷 第２期 ２０１８ 年３月 病 毒 学 报 ＣＨＩＮＥＳＥＪＯＵＲＮＡＬＯＦＶＩＲＯＬＯＧＹ Ｖｏｌ．３４ Ｎｏ．２ Ｍａｒｃｈ ２０１８ 人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 史晶洁１，宋硕１，王大宁２，李智海１，夏宁邵１，２，李少伟１，２＊ （１．厦门大学 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心 生命科学学院，厦门 ３６１１０２； ２．厦门大学 分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室 公共卫生学院，厦门 ３６１１０２） 摘要：病毒样颗粒（Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＶＬＰｓ）作为一种形态结构与真病毒高度相似的空心颗粒，具有真病毒类似 特性，在机体内能刺激免疫系统产生高滴度的中和抗体，又因为其缺乏核酸无法复制，近年来一直被作为理想的候 选疫苗蛋白。目前上市的三种人类乳头瘤病毒（Ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）疫苗都是属于基因工程 ＶＬＰ疫 苗。 对于 ＨＰＶ ＶＬＰ组装的研究能够更好的为疫苗研发方面提供更多的优化手段。该文旨在总结这十几年人乳头瘤 病毒 ＶＬＰ组装的研究进展，为 ＨＰＶ 以及其它病毒的基因工程疫苗研发提供更多有价值的信息，为人类健康作出 贡献。 关键词：人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）；主要衣壳蛋白 Ｌ１；病毒样颗粒（ＶＬＰｓ）；疫苗；组装 中图分类号：Ｒ３７３．９ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－８７２１（２０１８）０２－０２５２－０７ 收稿日期：２０１７－１０－３０；修回日期：２０１７－１２－１９ 基金项目：国家自然科 学 基 金 （项 目 号：３１６７０９３５），题 目：不 同 型别五聚体杂合的人乳头瘤病毒样颗粒的组装机制和型交叉免疫原 性的研究；国家自然 科 学 基 金（项 目 号：８１７０１６３７），题 目：人 乳 头 瘤 病毒１６、３１、３３和５８型别交叉中和表位的特征和初步定位；福 建 省 自然科学基金（项目号：２０１７Ｊ０７００５），题目：戊型肝炎病毒中和作用 和抗体间协同作用的机制及结构基础 作者简介：史晶洁（１９９２－），女，陕西西安人，硕士研究生，生物学 专业，主要从事 ＨＰＶ 病毒研究工作，Ｅ－ｍａｉｌ：３２９４２６４２０＠ｑｑ．ｃｏｍ ＊通讯作者：李少伟（１９７６－），博 士 生 导 师，教 授，主 要 从 事 分 子 病毒学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈａｏｗｅｉ＠ｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ 全球每年新发癌症病例中５％是由人乳头瘤病 毒引发的癌症（包括女性宫颈癌、阴道癌、男性阴茎 癌等），其中宫颈癌病例占据女性恶性肿瘤疾病第二 位。据 ＷＨＯ 世界卫生组织２０１２年癌症数据统计， 全球每年宫颈癌新生病例达５２．８万，且每年死亡病 例高达２６．６万［１－３］。我 国 每 年 有 近１０万 名 女 性 被 诊断出宫颈癌，且发病越来越趋 于 年 轻 化［４－６］，其 中 ９９．７％都是由 于 ＨＰＶ 感 染 所 引 起 的，所 以，ＨＰＶ 的研究刻不容缓。 人类乳头瘤病毒属乳头瘤病毒科（ｐａｐｏｖａｖｉｒｉ－ ｄａｅ）乳头瘤病毒属。乳头瘤病毒能感染人和多种高 级脊椎动物如兔、牛、狗等的皮肤粘膜，诱导产生上 皮组织的疣状增生乃至良恶性肿瘤。但由于乳头瘤 病毒的感染具有严格的宿主特异性，传统的病毒学 研究难以开展。直到１９世纪７０年代基因测序技术 的发展，它们与各种粘膜疾病的关系才被研究清楚。 ＨＰＶ 基因组由闭合环状双链 ＤＮＡ 分子构成， 不同型别间基因组长度不同，大小约７．２～８ｋｂ，包 含有８个开放阅读框，编码６个早期蛋白和２个晚 期蛋 白，以 及 １ 个 长 调 控 区（Ｌｏｎｇｃｏｎｔｒｏｌｒｅｇｉｏｎ， ＬＣＲ）。晚期基因区（Ｌ区）长度３０００ｂｐ左右，编码 ２个病毒衣壳蛋白，即病毒主要衣壳蛋白 Ｌ１和次要 衣壳蛋白Ｌ２。其中基因长约１．５ｋｂ的Ｌ１衣壳蛋白 是 ＨＰＶ 衣壳蛋 白 的 主 要 成 份，蛋 白 表 观 分 子 量 为 ５０～６０ｋＤ，占病 毒 衣 壳 蛋 白 总 量 的８０％～９０％［７］， 两种蛋白共同构成病毒的衣壳结构，与病毒入胞密 切相关。 １９９１年Ｆｒａｚｅｒ等人发现，ＨＰＶ 的Ｌ１蛋白可以 在体外培养表达。该蛋白在一定条件下可以自发组 装为与病毒颗粒结构高度一致的 ＶＬＰ。其由７２个 壳粒以 Ｔ＝７的二十面体形式组装而成。且每个壳 粒都是由５个主要衣壳蛋白 Ｌ１单体聚合形成五聚 体。另 外，Ｃｈｅｎ Ｘ Ｓ 等 人［８，９］在 ２００１ 年 解 析 出 ＨＰＶ１６Ｌ１Ｔ＝１的 三 维 结 构，表 明 ＨＰＶ Ｌ１在 一 定条件下也可组装成１２个壳粒的 Ｔ＝１的 二 十 面 体的“小 ＶＬＰ”。随后２０１０年 ＷｏｌｆＭ 等人［１０］解析 了 ＢＰＶ ＶＬＰＴ＝７ 的三维结构，揭示了 Ｌ１蛋白的 结构基础，是 ＨＰＶ 结构研究的重大突破。 研究表明，ＶＬＰ保留了与真病毒颗粒相似的构 象且具有近乎相同的中和表位，进入机体后能够激 发体内相应的免疫应答，预防 ＨＰＶ 病毒的入侵，且 ＶＬＰ不需要包裹遗传物质 ＤＮＡ 不具有相应的复制 能力，已被作为一种主流的 ＨＰＶ 疫苗形式［１１－１３］。 目前，上 市 的 ＨＰＶ 预 防 性 疫 苗 主 要 包 括 默 克 公司的 Ｇａｒｄａｓｉｌ 和史克公司的Ｃｅｒｖａｒｉｘ 。它们通 过真核表达 系 统 制 备 相 应 的 ＶＬＰ。而 国 内 由 本 实 验室夏宁邵老师团队自主研发的原核系统表达的 ＨＰＶ１６／１８（宫颈癌疫苗）目前正处在Ⅲ期临床试验 阶段，ＨＰＶ６／１１（尖锐湿疣疫苗）也处于Ⅱ期临床试 DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.003329

史晶洁,等.人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 253 验阶段。对于 HPV VLP各方面特性(热稳定性、颗装。但原核表达系统具有生产周期短、成本低廉、工 粒性、均一性、抗原性和免疫原性等)的监测与优化艺简单等优势。 是疫苗免疫机体达到最好的预防效果所必要的 除上述之外,还有一些应用相对较少的系统也 其中,组装过程直接影响到颗粒的颗粒性和均一性 可获得自组装的VLP,例如哺乳动物细胞和植物细 进而影响颗粒的抗原性和免疫原性等。该文旨在总胞表达载体的应用。2003和2005年有研究者分别 结近十几年ⅥLP组装的研究进展。这为HPⅤ真通过烟草和马铃薯植物细胞表达HPV16L1蛋白。 病毒的结构和感染机制的深入研究提供了更坚实的L.2HPvL1N端/C端截短 基础,并能够指导未来研发颗粒特性更优、保护更加 早在1996年, Paintsil J等人[通过构建不同 广谱、效果更强的VLP疫苗 长度的C端截短BPVL1蛋白研究其组装VLP的 lVLP的组装的影响因素 差异,发现截短C端471~495位氨基酸不但不影 L.1L1蛋白的表达系统 响VLP的组装,反而比野生型组装效率提高了近三 在对HPV了解更加深入的过程中,L1蛋白的倍。另外,靠近该区域的447~470有一高度保守区 表达系统也在不断优化与更新。这对于获得颗粒性域,当删除该区域时L1无法组装。2000年 Chen x 好、纯度高、抗原性与免疫原性强的VLP具有决定S等人发现HPV16L1N末端的氨基酸片段决 性作用。至今,HPVL1蛋白表达系统的研究已经定了L组装为由72个五聚体组成T=7的VLP 有10多年的历史。主流的表达系统包括:昆虫细胞还是T=1的“小VILP”结构。起初发现截短C末端 杆状病毒表达系统、酵母表达系统、细菌表达系统、30个及16个以内的氨基酸不会影响L1蛋白稳定 哺乳动物细胞表达系统以及植物细胞表达系统。 性和可溶性。但当C末端截取超过30个氨基酸会 在1992年, Kirnbauer r等人可首次发现导致产生不折叠且对胰蛋白酶敏感的终产物。而N BPV-1及HPⅤ16可通过杆状病毒载体在昆虫细末端一旦截短超过13及14个氨基酸便会造成L1 胞中表达LI1蛋白并自组装为VLP。他们发现无论蛋白的不稳定。紧接着他们进一步研究对HPV 是人或者动物类的PV病毒它们均能够在胞内完成11、HPV16L1组装的影响。在原有研究基础上发 自组装。在电镜下观察发现大部分颗粒呈现出直径现N末端截短20个以内的氨基酸时,除了HPV16 5onm左右的球型结构。HPV6、HPV11及棉尾兔L1△N10(即截短N端10个氨基酸残基)组装为T 乳头瘤病毒( Cottontail rabbit papillomavirus,=1的HPV16“小VLP”结构外,其他HPV16的截 CRPV)VLP结构也陆续被 Kirnbauer r解析。昆短突变体均可组装为T=7的正二十面体结构但尺 虫表达系统优势在于昆虫细胞可在无血清的培养基寸小于正常的VLP。另外,在研究晶体结构中发现 中的大规模培养,并且能进行必要的翻译后加工。N末端20个氨基酸和C末端30个氨基酸残基结构 但其表达的蛋白中容易混杂重组的杆状病毒(rB是较多变的。这也进一步印证截短固定数目的残基 Vs),所以对于后期的纯化要求更为严格。日前,不会影响组装。但这种组装成功与否结果并不是绝 Cervarix就是沿用的昆虫细胞杆状病毒载体表达对的。在1998年, Chen y等人在对COPV的截 系统[。而 Gardasil采用的则是酵母表达系统。短蛋白的组装和表位研究中提到N/C末端截短后 1995年, Hofmann K J等人17在啤酒酵母中以单其组装与否及形态差异与蛋白表达系统也有较大的 独表达重组L1蛋白或者L1/L2共表达的方式获得关系。2006年 Varsani a等人t通过透射电镜对 自组装的HPⅤ6aⅥLP。酵母细胞也可对表达的组其在杆状系统中表达截短蛋白组装情况进行分析, 装蛋白进行如糖基化和磷酸化修饰。目前常用的两发现C末端的428~465和h5对于H16VLP的组 种酵母是毕赤酵母( Pichia pastoris)和汉逊酵母装是不可或缺的。其中M△N10、M△N10△C483 ( Hansenula)。但真核系统面临着生产周期长、表组装为T=1、T=7两种结构。这与前文提及Chen 达量低、成本费用高昂且不易纯化等问题,使得更多XS的研究结果有所出入,作者猜测是因为表达系 的新兴的表达系统进入研究者的视野中。 统的差异和高盐低pH的组装环境造成颗粒构象的 1997年LiM等人研究发现HPV11可通改变 过大肠杆菌原核表达系统可溶性表达重组L1蛋L3半胱氨酸及二硫键 白。但与上述真核系统相比,其蛋白本身无法在胞 Brady JN等人自1977年起展开一系列研究发 内自组装,而须裂解细胞后在胞外一定的环境下组现二硫键对于VLP的稳定性具有重要意义。而后 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

验阶段。对于 ＨＰＶＶＬＰ各方面特性（热稳定性、颗 粒性、均一性、抗原性和免疫原性等）的监测与优化 是疫苗免疫机体达到最好的预防效果所必要的［１４］。 其中，组装过程直接影响到颗粒的颗粒性和均一性， 进而影响颗粒的抗原性和免疫原性等。该文旨在总 结近十几年 ＶＬＰ 组 装 的 研 究 进 展。这 为 ＨＰＶ 真 病毒的结构和感染机制的深入研究提供了更坚实的 基础，并能够指导未来研发颗粒特性更优、保护更加 广谱、效果更强的 ＶＬＰ疫苗。 １ ＶＬＰ的组装的影响因素 １．１ Ｌ１蛋白的表达系统 在对 ＨＰＶ 了解更加深入的过程中，Ｌ１蛋白的 表达系统也在不断优化与更新。这对于获得颗粒性 好、纯度高、抗原性与免疫原性强的 ＶＬＰ具有决定 性作用。至今，ＨＰＶ Ｌ１蛋白表达系 统 的 研 究 已 经 有１０多年的历史。主流的表达系统包括：昆虫细胞 杆状病毒表达系统、酵母表达系统、细菌表达系统、 哺乳动物细胞表达系统以及植物细胞表达系统。 在 １９９２ 年，Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ Ｒ 等 人［１５］ 首 次 发 现 ＢＰＶ－１及 ＨＰＶ１６可通过杆状病毒载体在昆虫细 胞中表达 Ｌ１蛋白并自组装为 ＶＬＰ。他们发现无论 是人或者动物类的 ＰＶ 病毒它们均能够在胞内完成 自组装。在电镜下观察发现大部分颗粒呈现出直径 ５０ｎｍ 左右的 球 型 结 构。ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１ 及 棉 尾 兔 乳 头 瘤 病 毒 （Ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌｒａｂｂｉｔ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ， ＣＲＰＶ）ＶＬＰ 结 构 也 陆 续 被 ＫｉｒｎｂａｕｅｒＲ 解 析。昆 虫表达系统优势在于昆虫细胞可在无血清的培养基 中的大规模 培 养，并且能进行必要的翻译后加工。 但其表达 的 蛋 白 中 容 易 混 杂 重 组 的 杆 状 病 毒（ｒＢ－ Ｖｓ），所以对于后期的纯化要求更为严格。目 前， Ｃｅｒｖａｒｉｘ 就是沿用的昆虫细胞杆状病毒载体表达 系统［１６］。而 Ｇａｒｄａｓｉｌ 采用的则是酵母表达系统。 １９９５年，ＨｏｆｍａｎｎＫＪ等 人［１７］在啤酒酵母中以单 独表达重组 Ｌ１蛋白或者 Ｌ１／Ｌ２共表达的方式获得 自组装的 ＨＰＶ６ａＶＬＰ。酵母细胞也可对表达的组 装蛋白进行如糖基化和磷酸化修饰。目前常用的两 种酵 母 是 毕 赤 酵 母 （Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）和 汉 逊 酵 母 （Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）。但真核系统面临着生产周期长、表 达量低、成本费用高昂且不易纯化等问题，使得更多 的新兴的表达系统进入研究者的视野中。 １９９７年 ＬｉＭ 等 人［１８］研 究 发 现 ＨＰＶ１１可 通 过大肠杆菌原核表达系统可溶 性表达重组 Ｌ１ 蛋 白。但与上述真核系统相比，其蛋白本身无法在胞 内自组装，而须裂解细胞后在胞外一定的环境下组 装。但原核表达系统具有生产周期短、成本低廉、工 艺简单等优势。 除上述之外，还有一些应用相对较少的系统也 可获得自组装的 ＶＬＰ，例如哺乳动物细胞和植物细 胞表达载体的应用。２００３和２００５年有研究者分别 通过烟草和马铃薯植物细胞表达 ＨＰＶ１６Ｌ１蛋白。 １．２ ＨＰＶＬ１Ｎ端／Ｃ端截短 早在１９９６年，ＰａｉｎｔｓｉｌＪ等人［１９］通过 构 建 不 同 长度的 Ｃ端截短 ＢＰＶＬ１蛋白研究其组装 ＶＬＰ的 差异，发 现 截 短 Ｃ 端４７１～４９５位 氨 基 酸 不 但 不 影 响 ＶＬＰ的组装，反而比野生型组装效率提高了近三 倍。另外，靠近该区域的４４７～４７０有一高度保守区 域，当删除该区域时 Ｌ１无法组装。２０００年 ＣｈｅｎＸ Ｓ等人［８，９］发现 ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ 末端的氨基酸片段决 定了 Ｌ１组 装 为 由７２个 五 聚 体 组 成 Ｔ＝７的 ＶＬＰ 还是 Ｔ＝１的“小 ＶＬＰ”结构。起初发现截短Ｃ末端 ３０个及１６个以内的氨基酸不 会 影 响 Ｌ１蛋 白 稳 定 性和可溶性。但当 Ｃ末端截取超过３０个氨基酸会 导致产生不折叠且对胰蛋白酶敏感的终产物。而 Ｎ 末端一旦截短超过１３及１４个氨基酸便会造成 Ｌ１ 蛋白的 不 稳 定。紧 接 着 他 们 进 一 步 研 究 对 ＨＰＶ １１、ＨＰＶ１６Ｌ１组装的影响。在原有研究基础上发 现 Ｎ 末端截短２０个以内的氨基酸时，除了 ＨＰＶ１６ Ｌ１△Ｎ１０（即截短 Ｎ 端１０个氨基酸残基）组装为 Ｔ ＝１的 ＨＰＶ１６“小 ＶＬＰ”结构外，其他 ＨＰＶ１６的截 短突变体均可组装为 Ｔ＝７的正二十面体结构但尺 寸小于正常的 ＶＬＰ。另外，在研究晶体结构中发现 Ｎ 末端２０个氨基酸和Ｃ末端３０个氨基酸残基结构 是较多变的。这也进一步印证截短固定数目的残基 不会影响组装。但这种组装成功与否结果并不是绝 对的。在１９９８年，ＣｈｅｎＹ 等人［２０］在对 ＣＯＰＶ 的截 短蛋白的组装和表位研究中提到 Ｎ／Ｃ 末 端 截 短 后 其组装与否及形态差异与蛋白表达系统也有较大的 关系。２００６年 ＶａｒｓａｎｉＡ 等 人［２１］通 过 透 射 电 镜 对 其在杆状系统中表达截短蛋白组装情况进行分析， 发现 Ｃ末端的４２８～４６５和ｈ５对于 Ｈ１６ＶＬＰ的组 装是不可或缺的。其中 Ｍ－△Ｎ１０、Ｍ－△Ｎ１０△Ｃ４８３ 组装为 Ｔ＝１、Ｔ＝７两种结构。这与前文提及 Ｃｈｅｎ ＸＳ的研究结果有所出 入，作者猜测是因为表达系 统的差异和高盐低ｐＨ 的组装环境造成颗粒构象的 改变。 １．３ 半胱氨酸及二硫键 ＢｒａｄｙＪＮ 等人自１９７７年起展开一系列研究发 现二硫键对于 ＶＬＰ的稳定性具有重要意义。而后 ２期 史晶洁，等．人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 · ３５２ ·

254 1986年 Garcea r i等人[2在研究多瘤病毒VLP型可能会造成VLP稳定性的差异。所以对NaCl、 体外组装也验证了该结论。SapM等人[]也有研MgCl2、CaCl2、柠檬酸钠盐、磷酸盐、EDTA、醋酸盐 究提及DTT(DL-υ Dithiothreitol,二硫苏糖醇,CH1。和硫酸盐的稳定性进行比较,发现HPVⅥLP稳定 O2S2)可以破坏HPV33VLP结构。早期研究都不性取决于溶液中的盐离子强度而非盐离子的类型。 同程度反映了二硫键在VLP组装过程中的重要性。高浓度的盐离子(主要为NaCl)可以促进并稳定 但并不清楚二硫键具体的数量、位置及作用机理。VLP的组装。其作用机理与VLP二硫键的形成有 直至1997年LiM等人[2通过建立系统的方法(包关。但在另外 Hanslip s J等人研究中发现对于 括L1蛋白对胰蛋白酶的敏感性、电镜观察颗粒、大肠杆菌表达系统表达的L1蛋白而言,NaCl对 DNase i对BPV基因组的作用、分析超速离心等)VLP的组装并没有明显作用,甚至还有聚集现象出 分析各因素对BPⅤ结构的影响。作者基于多瘤病现。 毒和猴空泡病毒的研究,发现HPV11突变蛋白L43pH (C424替换为甘氨酸)可以组装为五聚体但无法进 在很多 HPV VLP文章中都提及到缓冲液中 步组装为VLP。且相比野生型VLP它会更快速pH对组装也有或多或少的影响。但针对具体pH 地被胰蛋白酶消化解离。因而C424涉及五聚体间的相关研究却少之又少。直到2008年 Mukherjee 的二硫键连接。2003年 Ishii y等人[2同样以S3通过动态光散射、投射电镜、分析超离技术开展 HPV16L1为研究对象,分别将半胱氨酸替换为丝了一些针对pH变化影响 HPV VLP重新组装的研 氨酸,发现C175、C185和C428参与二聚体和三聚究。作者发现pH是在还原环境下依赖于分子动力 体形成进而组装为VIP。此外,C161、C229、C379学以及离子强度从而实现对组装的影响。将高浓度 对于维持VLP的稳定也有重要作用。该研究结果解离的VLP(即五聚体)分别置于pH5.2、pH6.2 也提出加入相应的氧化还原剂例如DTT、谷胱甘肽pH7.2、pH&2的环境(均为1 M NaCl、1mM 等破坏其半胱氨酸间的二硫键能够影响VLP组装。DTT)中重新组装。从动态光散射结果得知,在低 L.4组装环境 浓度的还原剂条件下随着溶液pH升高VLP组装 L.41表面活性剂 速率不断降低。其中,pH5.2在短时间内五聚体聚 非离子活性剂作为一种被广泛用于稳定蛋白质集速度极快,但后期长时间处于平衡饱和的状态;在 结构的辅助性试剂,在 HPV VLP中的应用也在被组装的形态方面比较,作者通过投射电镜对组装后 不断摸索。2005年ShiL等人[针对这7种常见的VLP进行24h观察,发现pH62、pH.2、pH 的非离子活性剂进行分析,包括PS20( Polysorbate82重新组装VLP均呈现出直径45nm左右粗糙的 20)、PS80、NP40、 Triton x-100、 Triton x-114、Brij球型结构,其中pH62的直径略小。而pH52却 35及Brij58。研究发现在50℃Q.15 M NaCl的溶出现了五聚体聚集的现象,没有发现VLP的存在, 液环境中,浓度为001%各种活性剂对HPV11与动态光的结果相一致。作者猜测是因为溶液中 VLP结构稳定的作用不会发生改变,并能够阻止其pH的差异导致构象上的相互作用不同。但是,pH 发生解聚。其中PS80的效果最为显著。作者发现只能够作为五聚体重新组装的必要条件。 非离子活性剂可能降低吸附作用的机理主要分为两144尿素 种:溶解和代替。溶解机制是通过非离子活性剂与 Hanslip S J等人[3发现即使在氧化和还原型 蛋白质发生结合形成相应的复合物阻止其吸附于容谷胱甘肽存在的环境中,2M尿素的存在也能够促 器表面;另一种例如PS80并不直接与VLP作用,进VLP组装。作者分析称尿素使得衣壳结构变得 而是替代VLP附着于玻璃或塑料材质容器表面。松散,因而能够克服谷胱甘肽与半胱氨酸作用产生 另外研究发现决定非离子活性剂的作用效果除了活的位阻效应。但尿素这种促进VLP组装的作用是 性剂本身种类外仍取决于其蛋白浓度及储存温通过加快组装速度但对于最终组装VLP的浓度并 度 没有改变。 L.42盐离子种类及浓度 L.5VLP蛋白浓度 组装环境中盐离子的作用也会对 HPV VLP组 ShiL等人2同样也在研究中发现低浓度的 装有所影响,这种影响包括解聚和组装两个方面。 HPV VLP容易发生解聚。尽管维持在125M高 最初 McCarthy M P等人0猜测不同盐离子的类盐浓度的溶液中,浓度低的VLP依然会发生解聚。 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

１９８６年 ＧａｒｃｅａＲＬ 等 人［２２］在研究多瘤病毒 ＶＬＰ 体外组装也验证了该结论。ＳａｐｐＭ 等人［２３］也有研 究提及 ＤＴＴ（ＤＬ－Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ，二硫苏糖醇，Ｃ４Ｈ１０ Ｏ２Ｓ２）可以破坏 ＨＰＶ３３ＶＬＰ结构。早期研究都不 同程度反映了二硫键在 ＶＬＰ组装过程中的重要性。 但并不清楚 二 硫 键 具 体 的 数 量、位置及作用机理。 直至１９９７年 ＬｉＭ 等人［２４］通过建立系统的方法（包 括 Ｌ１ 蛋 白 对 胰 蛋 白 酶 的 敏 感 性、电 镜 观 察 颗 粒、 ＤＮａｓｅＩ对 ＢＰＶ 基 因 组 的 作 用、分析超速离心等） 分析各因素对 ＢＰＶ 结构的影响。作者基于多瘤病 毒和猴 空 泡 病 毒 的 研 究，发 现 ＨＰＶ１１ 突 变 蛋 白 （Ｃ４２４替换为甘氨酸）可以组装为五聚 体 但 无 法 进 一步组装为 ＶＬＰ。且相比野生型 ＶＬＰ它会更快速 地被胰蛋白酶消化解离。因而 Ｃ４２４涉及五聚体间 的二 硫 键 连 接。２００３ 年 ＩｓｈｉｉＹ 等 人［２５］同 样 以 ＨＰＶ１６Ｌ１为研究对象，分别将半胱氨酸替换为丝 氨酸，发现 Ｃ１７５、Ｃ１８５和 Ｃ４２８参与二聚体和三聚 体形成 进 而 组 装 为 ＶＬＰ。此 外，Ｃ１６１、Ｃ２２９、Ｃ３７９ 对于维持 ＶＬＰ的稳定也有重要作用。该研究结果 也提出加入相应的氧化还原剂例如 ＤＴＴ、谷胱甘肽 等破坏其半胱氨酸间的二硫键能够影响 ＶＬＰ组装。 １．４ 组装环境 １．４．１ 表面活性剂 非离子活性剂作为一种被广泛用于稳定蛋白质 结构的辅助性试剂，在 ＨＰＶ ＶＬＰ中的应用也在被 不断摸索。２００５年 ＳｈｉＬ 等人［２６］针对 这７种 常 见 的非离子活 性 剂 进 行 分 析，包 括 ＰＳ２０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ２０）、ＰＳ８０、ＮＰ－４０、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４、Ｂｒｉｊ ３５及 Ｂｒｉｊ５８。研究发现在５０℃ ０．１５Ｍ ＮａＣｌ的溶 液环 境 中，浓 度 为 ０．０１％ 各 种 活 性 剂 对 ＨＰＶ１１ ＶＬＰ结构稳定的作用不会发生改变，并能够阻止其 发生解聚。其中 ＰＳ８０的效果最为显著。作者发现 非离子活性剂可能降低吸附作用的机理主要分为两 种：溶解和代替。溶解机制是通过非离子活性剂与 蛋白质发生结合形成相应的复合物阻止其吸附于容 器表面；另 一 种 例 如 ＰＳ８０并 不 直 接 与 ＶＬＰ 作 用， 而是替代 ＶＬＰ 附着于玻璃或塑料材质容器表 面。 另外研究发现决定非离子活性剂的作用效果除了活 性剂本身种类外仍取决于其蛋 白 浓 度 及 储 存 温 度［２７－２９］。 １．４．２ 盐离子种类及浓度 组装环境中盐离子的作用也会对 ＨＰＶＶＬＰ组 装有所影响，这种影响包括解聚和组装两个方 面。 最初 ＭｃＣａｒｔｈｙＭ Ｐ 等 人［３０］猜测不同盐离子的类 型可能会造成 ＶＬＰ 稳 定 性 的 差 异。所 以 对 ＮａＣｌ、 ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、柠檬酸钠 盐、磷 酸 盐、ＥＤＴＡ、醋 酸 盐 和硫酸盐的稳定性进行比较，发现 ＨＰＶ ＶＬＰ稳定 性取决于溶液中的盐离子强度而非盐离子的类型。 高 浓 度 的 盐 离 子 （主 要 为 ＮａＣｌ）可以促进并稳定 ＶＬＰ的组装。其作用机理与 ＶＬＰ二硫键的形成有 关。但在另外 ＨａｎｓｌｉｐＳＪ等人［３１］研究中发现对于 大肠 杆 菌 表 达 系 统 表 达 的 Ｌ１ 蛋 白 而 言，ＮａＣｌ对 ＶＬＰ的组装并没有明显作用，甚至还有聚集现象出 现。 １．４．３ ｐＨ 在很多 ＨＰＶ ＶＬＰ 文章中都提及到缓冲液中 ｐＨ 对组装也 有 或 多 或 少 的 影 响。但 针 对 具 体 ｐＨ 的相关研 究 却 少 之 又 少。直 到２００８年 Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ Ｓ［３２］通过动态光散射、投射电镜、分析超离技术开展 了一些针对ｐＨ 变化影响 ＨＰＶ ＶＬＰ重新组装的研 究。作者发现ｐＨ 是在还原环境下依赖于分子动力 学以及离子强度从而实现对组装的影响。将高浓度 解离的 ＶＬＰ（即五聚体）分别置于ｐＨ５．２、ｐＨ６．２、 ｐＨ７．２、ｐＨ ８．２ 的 环 境 （均 为 １Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ）中重 新 组 装。从动态光散射结果得 知，在 低 浓度的还原剂条件下随 着 溶 液 ｐＨ 升 高 ＶＬＰ 组 装 速率不断降低。其中，ｐＨ５．２在短时间内五聚体聚 集速度极快，但后期长时间处于平衡饱和的状态；在 组装的形态方面比较，作者通过投射电镜对组装后 的 ＶＬＰ 进 行２４ｈ观 察，发 现 ｐＨ６．２、ｐＨ７．２、ｐＨ ８．２重新组装 ＶＬＰ均呈现出直径４５ｎｍ 左右粗糙的 球型结构，其中ｐＨ６．２的直径略小。而ｐＨ５．２却 出现了五聚体聚集的现象，没有发现 ＶＬＰ的存在， 与动态光 的 结 果 相 一 致。作 者 猜 测 是 因 为 溶 液 中 ｐＨ 的差异导致构象上的相互作用不同。但是，ｐＨ 只能够作为五聚体重新组装的必要条件。 １．４．４ 尿素 ＨａｎｓｌｉｐＳＪ等人［３１］发现即使在氧化和还原型 谷胱甘肽存在 的 环 境 中，２Ｍ 尿素的存在也能够促 进 ＶＬＰ组装。作者分析称尿素使得衣壳结构变得 松散，因而能够克服谷胱甘肽与半胱氨酸作用产生 的位阻效应。但尿素这种促进 ＶＬＰ组装的作用是 通过加快组装速度但对于最终组装 ＶＬＰ的浓度并 没有改变。 １．５ ＶＬＰ蛋白浓度 ＳｈｉＬ等 人［２６］同样也在研究中发现低浓度的 ＨＰＶ ＶＬＰ容易 发 生 解 聚。尽 管 维 持 在１．２５Ｍ 高 盐浓度的溶液中，浓度低的 ＶＬＰ依然会发生解聚。 · ４５２ · 病 毒 学 报 ３４卷

史晶洁,等.人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 255 所以 HPV VLP长期储存须浓缩至高浓度。 已知HPⅤVLP具有较强的表面活性且部分疏 L6L2蛋白 水表面暴露。在外界人为地涡流、搅拌、震荡、抽吸 作为同为晚期蛋白的次要衣壳蛋白L2,其在组等操作过程中会使得空气与溶液表面充分接触,使 装中作用的研究也未被忽略。众多研究中都提及到得VLP和外界组分的相互作用增强。进而蛋白质 HPVL1可以在没有L2的参与下自组装为VLP。变性或VLP解离 但在真实的感染过程中,L2在包裹病毒基因进入病2小结与展望 原体过程中起到了关键性作用。在1992年,Kirm 目前, HPV VLP除了本身作为疫苗外,还广泛 bauer r等人3提出了L2能够协助L1完成VLP应用在嵌合VLP疫苗以及作为VLP载体35 结构组装的猜测。第二年,他就证明了自己的假设。方面VLP能够接受外源片段的插入并融合表达,可 作者利用杆状病毒双表达系统共转染HPV16、将抗原的重要表位在VLP表面进行展示。 Kanda CRPV、BPVL1/L2,发现相比在仅有L1参与的情T等人构建了HPV16L1/L2共表达的嵌合 况下,L1/L2ⅥLP产量提高了近4倍。2005年VLP,发现免疫的家兔血清中的抗体能够中和 Ishii y等人对HPV16VLP组装过程中L2的HPV18、HPV31、HPV52、HPV58假病毒。另一方 作用进行了详细的研究。研究表明L2本身不与L1面,有研究表明VLP能够作为呈递质粒DNA或者 组装后完整的衣壳体连接,它可与L1的衣壳粒即蛋白质表位的载体。 五聚体结合形成复合物,并且L2可以在没有二硫 1992年首次发现BPV-1及HPV16可通过杆 键参与的基础上辅助五聚体构成类似“小ⅤLP”的状病毒载体在昆虫细胞中表达L1蛋白并自组装为 结构。L2能促使本不能形成VLP的L1突变蛋白VLP。以此为起点,HPⅤVLP组装各方面的研究 (如HPV16的C175S或C428S)形成VLP。但拉开了帷幕。在表达系统方面,真核和原核研究应 L2并不是ⅥLP组装的关键蛋白,其作用可能通过用最为广泛且各具优点。对于需要严格加工修饰的 病毒DNA的包装才得以体现 蛋白适合于真核表达系统,而看重生产工艺、产量、 L.7温度 成本等因素的蛋白则更适合原核表达。在分子层面 HPⅴⅥLP的储存也有一定的环境温度要求。上,常常需要截短N/C端数个氨基酸使得L1大量 LⅠ等人除研究表面活性剂的因素以外,针对VLP稳定表达。研究者在多次实验后发现当截短N端 溶液所处的温度也进行了探究。他将HPV11VLP不多于20个或C端不超过30个氨基酸时VLP能 从4℃环境转移至室温(22℃)放置,并监测0~10d够正常组装(N端截短10个氨基酸时形成T=1的 VLP直径变化。发现当温度从4℃逐渐升高至室“小”VLP)。除HPVL1蛋白自身因素的影响外, 温,VLP的聚集现象明显[。 外界环境因素也直接或间接的影响VLP组装。在 L.8透析 PS80等表面活性剂的参与下,pH7.2的高盐组装 ShiL等人[研究发现经透析后的VLP直径溶液、合适的储存温度和容器、L2的参与都能明显 相比透析前有所增加并会引起一定程度的聚集。且提高组装效率。将这些研究成果综合应用于HPV 其蛋白浓度降低与透析膜的尺寸成比例。可知,透VLP,能够获得纯度高、颗粒性、稳定性好的蛋白,进 析膜的吸附能力会造成VLP的聚集。 而能够提高其免疫原性与反应性,为疫苗的研发及 L.9解离后再组装 后期质控奠定了良好的基础 解离后再组装的实验方法常被用于优化VLP 目前,许多研究成果都表明HPⅤVLP免疫能 的结构。 Mach h等人发现将HPV6、HPV1l、够产生高滴度的中和抗体,上市的ⅤLP疫苗也都能 HPV16VLP解离后再组装(通过改变离子强度、pH够达到良好的预防效果。但随着抗原种类增加达到 及添加氧化还原剂等条件实现),其直径会从不规则更广泛的保护效果同时生产工艺、安全性都会成为 的30~50mm增大至理想直径60nm的规则颗粒。问题。因而市场目前迫切须要 HPV VLP的广谱疫 在物化性质方面,再组装的VLP热稳定性有5~苗的出现;另一方面,对于VLP在机体内的免疫机 10℃的提高。但并不是所有HPV都具有该特质。制的研究尚不清楚。 HPV VLP是如何进入机体内 作者提到因HPV18VLP本身在酵母细胞中都能够剌激免疫系统进行应答,其免疫效果的强弱又与 很好的组装,所以处理前后没有明显差异 VLP的哪些方面有关。针对免疫机制相关的深入 L.10机械外力因素 研究,了解VLP在机体内的免疫保护过程,对于不 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

所以 ＨＰＶ ＶＬＰ长期储存须浓缩至高浓度。 １．６ Ｌ２ 蛋白 作为同为晚期蛋白的次要衣壳蛋白 Ｌ２，其在组 装中作用的研究也未被忽略。众多研究中都提及到 ＨＰＶＬ１可以在没有 Ｌ２的参与下自组装为 ＶＬＰ。 但在真实的感染过程中，Ｌ２在包裹病毒基因进入病 原体过程中起到了关键性作 用。在１９９２年，Ｋｉｒｎ－ ｂａｕｅｒＲ等人［３３］提出 了 Ｌ２能 够 协 助 Ｌ１完 成 ＶＬＰ 结构组装的猜测。第二年，他就证明了自己的假设。 作者利 用 杆 状 病 毒 双 表 达 系 统 共 转 染 ＨＰＶ １６、 ＣＲＰＶ、ＢＰＶＬ１／Ｌ２，发现 相 比 在 仅 有 Ｌ１参 与 的 情 况 下，Ｌ１／Ｌ２ ＶＬＰ 产 量 提 高 了 近 ４ 倍。２００５ 年 ＩｓｈｉｉＹ 等人［３４］对 ＨＰＶ１６ＶＬＰ组装过程中 Ｌ２的 作用进行了详细的研究。研究表明Ｌ２本身不与Ｌ１ 组装后完整的 衣 壳 体 连 接，它 可 与 Ｌ１的 衣 壳 粒 即 五聚体结合形 成 复 合 物，并 且 Ｌ２可以在没有二硫 键参与的基础上辅助五聚体构成类似“小 ＶＬＰ”的 结构。Ｌ２能促使本不能形成 ＶＬＰ的 Ｌ１突变蛋白 （如 ＨＰＶ１６的 Ｃ１７５Ｓ或 Ｃ４２８Ｓ）形成 ＶＬＰ［２５］。但 Ｌ２并不是 ＶＬＰ组装的关键蛋 白，其 作 用 可 能 通 过 病毒 ＤＮＡ 的包装才得以体现。 １．７ 温度 ＨＰＶ ＶＬＰ的储存也有一定的环境温度要求。 ＬＩ等人除研 究 表 面 活 性 剂 的 因 素 以 外，针 对 ＶＬＰ 溶液所处的温度也进行了探究。他将 ＨＰＶ１１ＶＬＰ 从４℃环境转移至室温（２２℃）放置，并监测０～１０ｄ ＶＬＰ直 径 变 化。发 现 当 温 度 从４℃逐 渐 升 高 至 室 温，ＶＬＰ的聚集现象明显［２５］。 １．８ 透析 ＳｈｉＬ等人［２６］研究发现经透 析 后 的 ＶＬＰ 直 径 相比透析前有所增加并会引起一定程度的聚集。且 其蛋白浓度降低与透析膜的尺寸成比例。可知，透 析膜的吸附能力会造成 ＶＬＰ的聚集。 １．９ 解离后再组装 解离后再组 装 的 实 验 方 法 常 被 用 于 优 化 ＶＬＰ 的结 构。Ｍａｃｈ Ｈ 等 人［１１］发 现 将 ＨＰＶ６、ＨＰＶ１１、 ＨＰＶ１６ＶＬＰ解离后再组装（通过改变离子强度、ｐＨ 及添加氧化还原剂等条件实现），其直径会从不规则 的３０～５０ｎｍ 增 大 至 理 想 直 径６０ｎｍ 的 规 则 颗 粒。 在物化 性 质 方 面，再 组 装 的 ＶＬＰ 热 稳 定 性 有 ５～ １０℃的 提 高。但 并 不 是 所 有 ＨＰＶ 都 具 有 该 特 质。 作者提到因 ＨＰＶ１８ＶＬＰ本身在酵母细胞中都能够 很好的组装，所以处理前后没有明显差异。 １．１０ 机械外力因素 已知 ＨＰＶＶＬＰ具有较强的表面活性且部分疏 水表面暴露。在外界人为地涡流、搅拌、震荡、抽吸 等操作过程中会使得空气与溶液表面充分接触，使 得 ＶＬＰ和外界组分的相互作用增强。进而蛋白质 变性或 ＶＬＰ解离。 ２ 小结与展望 目前，ＨＰＶ ＶＬＰ除了本身作为疫苗外，还广泛 应用在嵌合 ＶＬＰ 疫 苗 以 及 作 为 ＶＬＰ 载 体［３５］。一 方面 ＶＬＰ能够接受外源片段的插入并融合表达，可 将抗 原 的 重 要 表 位 在 ＶＬＰ 表 面 进 行 展 示。Ｋａｎｄａ Ｔ 等 人［３６］构 建 了 ＨＰＶ１６Ｌ１／Ｌ２ 共 表 达 的 嵌 合 ＶＬＰ，发现免疫的家兔血清中的抗体能够中和 ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５８假病 毒。另 一 方 面，有研究表明 ＶＬＰ能够作为呈递质粒 ＤＮＡ 或者 蛋白质表位的载体。 １９９２年首次发现 ＢＰＶ－１及 ＨＰＶ１６可通过杆 状病毒载体在昆虫细胞中表达 Ｌ１蛋白并自组装为 ＶＬＰ。以此为起 点，ＨＰＶ ＶＬＰ 组 装 各 方 面 的 研 究 拉开了帷幕。在表达系统方面，真核和原核研究应 用最为广泛且各具优点。对于需要严格加工修饰的 蛋白适合于真核表达系统，而看重生产工艺、产量、 成本等因素的蛋白则更适合原核表达。在分子层面 上，常常需要截短 Ｎ／Ｃ端数个氨基酸使得 Ｌ１大量 稳定表达。研究者在多次实验后发现当截 短 Ｎ 端 不多于２０个或 Ｃ端不超过３０个氨基酸时 ＶＬＰ能 够正常组装（Ｎ 端截短１０个氨基酸时形成 Ｔ＝１的 “小”ＶＬＰ）。除 ＨＰＶ Ｌ１蛋 白 自 身 因 素 的 影 响 外， 外界环境因素也直接或间接的影响 ＶＬＰ组装。在 ＰＳ８０等表面活性 剂 的 参 与 下，ｐＨ７．２的 高 盐 组 装 溶液、合适的储存温度和容器、Ｌ２的 参 与 都 能 明 显 提高组装效率。将这些研究成果综合应用于 ＨＰＶ ＶＬＰ，能够获得纯度高、颗粒性、稳定性好的蛋白，进 而能够提高其免疫原性与反应性，为疫苗的研发及 后期质控奠定了良好的基础。 目前，许多研究成果都表明 ＨＰＶ ＶＬＰ免疫能 够产生高滴度的中和抗体，上市的 ＶＬＰ疫苗也都能 够达到良好的预防效果。但随着抗原种类增加达到 更广泛的保护效果同时生产工艺、安全性都会成为 问题。因而市场目前迫切须要 ＨＰＶＶＬＰ的广谱疫 苗的出现；另一方面，对于 ＶＬＰ在机体内的免疫机 制的研究尚不清楚。ＨＰＶ ＶＬＰ是如何进入机体内 刺激免 疫 系 统 进 行 应 答，其 免 疫 效 果 的 强 弱 又 与 ＶＬＰ的哪些方 面 有 关。针 对 免 疫 机 制 相 关 的 深 入 研究，了解 ＶＬＰ在机体内的免疫保护过程，对于不 ２期 史晶洁，等．人乳头瘤病毒样颗粒组装研究进展 · ５５２ ·

256 久的将来研发广谱疫苗有极大的帮助。相信在众科 [J]. Expert Rev Vaccines, 2010. 9(10): 1149-1176 学家的努力之下,问题都会被一一解决,会有更多高[13] Buonaguro F, Buonaguro I. The application of virus- 质量的HPV疫苗应用于疾病治疗当中,为人类健 like particles to human diseases[J]. Expert Rev Vac- 康提供更多的保障 cities,2013,12(2):99. [14] Inglis S, Shaw A, Koenig S. Chapter 11: Hpv vac- 参考文献 cines: Commercial research & development[J]. Va [1] Torre L. A, Bray F. Siegel R L, Ferlay ].Lortet-Tieur cine,2006,24 Suppl24(3):99-1 lent, Jemal A. Global cancer statistics, 2012[J]. CA L5] Kirnbauer r. booy F, Cheng N, Lowy DR. Schiller J T. Papillomavirus LI major capsid protein self-assem- Cancer J Clin,2015,65(2):87-108 bles into virus-like particles that are highly immuno- [2] Bray F, Ren J S, Masuyer E, Ferlay J. Global estimates in 2008LJJ. Int J Cancer, 2013, 132(5): 1133-1Is ion genic[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(24) of cancer prevalence for 27 sites in the adult popul 12180-12184. J Shi J F, Qiao Y L, Smith J S, Dondog B, Bao Y P,Dai [16]于永利.病毒样颗粒抗原的表达、纯化、组装和鉴定 Clifford G M, Franceschi S. Epidemiology and pre- 冂].微生物学免疫学进展,2014,42(1):1-8 vention of human papillomavirus and cervical cancer in [17] Hofmann KJ. Cook JC, Joyce JG, Brown DR, Schultz China and Mongolia[J]. Vaccine, 2008, 26 Suppl(12): LD, George HA, Rosolowsky M. Fife KH, Jansen KU. Sequence determination of human papillomavirus [4]蒋雪梅,李华,顿耀艳,宫颈癌的研究新进展[J].现代医 type 6a and assembly of virus-like particles in Saccha- 药卫生,2015,31(21):3251-3253 romyces cerevisiae. [J]. Virology, 1995 1: 209(2): [5]夏巧凡,何莲芝.人乳头瘤病毒疫苗预防宫颈癌的应用 506-518 [J].国际妇产科学杂志,2015,42(4):466-469 [18] Li M, Cripe T P, Estes P A, Lyon M K, Rose R C [6]Song D, Li H, Li H, Dai J. Effect of human papilloma- Garcea R L. Expression of the human papillomavi virus infection on the immune system and its role in the type 1l Ll capsid protein in Escherichia coli Charac- course of cervical cancer[J]. Oncol Lett, 2015, 10(2) terization of protein domains involved in dna binding and capsid assembly[J].J Virol, 1997.71(4):2988- [7] Sanders M, Kovalevskiy O V, Sizov D, Lebedev A A.Isupov M N, Antson A A. Papillomavirus El heli- [19] Paintsil ]. Muller M, Picken M. Gissmann L, Zhou J ains an asymmetric state in the ab- Carboxyl terminus of bovine papillomavirus type-1 L sence of DNA and nucleotide cofactors [J]. Nucleic protein is not required for capsid formation[J]. virolo- Acids res,2007,35(19):6451-645 y,1996,223(1):238-244. [8]Chen X S. Casini G. Harrison S C. Garcea L. Papil- [20] Chen Y, Ghim S J, Jenson A B, Schlegel R. Mutant lomavirus capsid protein expression in Escherichia coli: canine oral papillomavirus Ll capsid proteins which Purification and assembly of hpvll and hpv16 LI[J].J form virus-like particles but lack native conformational Mol biol,2001,307(1):173-182 epitopes[J]. J Gen Virol, 1998,79(Pt 9):2137-2146 [9] Chen X S. Garcea R L, Goldberg 1, Casini G, Harrison [21] Varsani A. Williamson A L, Jaffer M A. RybickiEP SC. Structure of small virus-like particles assembled a deletion and point mutation study of the human papr from the LI protein of human papillomavirus 16[J] illomavirus type 16 major capsid gene[J]. Virus Res Mol Cell2000,5(3):557-567. 2006,122(1-2):154-163 [1o] Wolf M. Garcea R L, Grigorieff N, Harrison S C. [22] Garcea R L, Salunke D M, Caspar D L. Site-directed Subunit interactions in bovine papillomavirus[J].Proc mutation affecting polyomavirus capsid self-assembly Natl Acad Sciusa,2010,107(14):6298-6303 n vitro[J]. Nature,1987,329(6134):86-87 [11] Mach H, Volkin D B. Troutman R D. Wang B. Luo [23] Sapp M, Volpers C, Muller M, Streeck R E.Organi- Z, Jansen K U, Shi L. Disassembly and reassembly of zation of the major and minor capsid proteins in human yeast-derived recombinant human papillomavirus virus papillomavirus type 33 virus-like particles [J]. J Gen like particles(HPV VLPs)[J]. J Pharm Sci, 2006,95 Virol,1995,76(Pt9):2407-2412. (10):2195-2206 [24] Li M, Beard P, Estes P A, Lyon M K, Garcea R L. [12] Roldao A, Mellado M C, Castilho L R, Carrondo M J Intercapsomeric disulfide bonds in papillomavirus Alves P M sembly and disassembly [J]. J Virol. 1998, 72(3): 21994-2018ChinaAcademicJOurnalElectronicpUblishingHouse.Allrightsreservedhttp:/www.cnki.net

久的将来研发广谱疫苗有极大的帮助。相信在众科 学家的努力之下，问题都会被一一解决，会有更多高 质量的 ＨＰＶ 疫 苗 应 用 于 疾 病 治 疗 当 中，为 人 类 健 康提供更多的保障。 参考文献： ［１］ＴｏｒｒｅＬＡ，ＢｒａｙＦ，ＳｉｅｇｅｌＲＬ，ＦｅｒｌａｙＪ，Ｌｏｒｔｅｔ－Ｔｉｅｕ－ ｌｅｎｔＪ，ＪｅｍａｌＡ．Ｇｌｏｂａｌｃａｎｃｅｒｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，２０１２［Ｊ］．ＣＡ ＣａｎｃｅｒＪＣｌｉｎ，２０１５，６５（２）：８７－１０８． ［２］ＢｒａｙＦ，ＲｅｎＪＳ，ＭａｓｕｙｅｒＥ，ＦｅｒｌａｙＪ．Ｇｌｏｂａｌｅｓｔｉｍａｔｅｓ ｏｆｃａｎｃｅｒｐｒｅｖａｌｅｎｃｅｆｏｒ２７ｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅａｄｕｌｔｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ２００８［Ｊ］．ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ，２０１３，１３２（５）：１１３３－１１４５． ［３］ＳｈｉＪＦ，ＱｉａｏＹＬ，ＳｍｉｔｈＪＳ，ＤｏｎｄｏｇＢ，ＢａｏＹＰ，Ｄａｉ Ｍ，ＣｌｉｆｆｏｒｄＧ Ｍ，ＦｒａｎｃｅｓｃｈｉＳ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙａｎｄｐｒｅ－ ｖｅｎｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓａｎｄｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒｉｎ ＣｈｉｎａａｎｄＭｏｎｇｏｌｉａ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８，２６Ｓｕｐｐｌ（１２）： ５３－５９． ［４］蒋雪梅，李华，顿耀艳．宫颈癌的研究新 进 展［Ｊ］．现 代 医 药卫生，２０１５，３１（２１）：３２５１－３２５３． ［５］夏巧凡，何莲 芝．人乳头瘤病毒疫苗预防宫颈癌的应用 ［Ｊ］．国际妇产科学杂志，２０１５，４２（４）：４６６－４６９． ［６］ＳｏｎｇＤ，ＬｉＨ，ＬｉＨ，ＤａｉＪ．Ｅｆｆｅｃｔｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａ－ ｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍａｎｄｉｔｓｒｏｌｅｉｎｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅｏｆｃｅｒｖｉｃａｌｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＯｎｃｏｌＬｅｔｔ，２０１５，１０（２）： ６００－６０６． ［７］ＳａｎｄｅｒｓＣ Ｍ，ＫｏｖａｌｅｖｓｋｉｙＯ Ｖ，ＳｉｚｏｖＤ，ＬｅｂｅｄｅｖＡ Ａ，ＩｓｕｐｏｖＭ Ｎ，ＡｎｔｓｏｎＡ Ａ．ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＥ１ｈｅｌｉ－ ｃａｓｅａｓｓｅｍｂｌｙｍａｉｎｔａｉｎｓａｎａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｔａｔｅｉｎｔｈｅａｂ－ ｓｅｎｃｅｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｃｏｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ，２００７，３５（１９）：６４５１－６４５７． ［８］ＣｈｅｎＸＳ，ＣａｓｉｎｉＧ，ＨａｒｒｉｓｏｎＳＣ，ＧａｒｃｅａＲＬ．Ｐａｐｉｌ－ ｌｏｍａｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ： Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｈｐｖ１１ａｎｄｈｐｖ１６Ｌ１［Ｊ］．Ｊ ＭｏｌＢｉｏｌ，２００１，３０７（１）：１７３－１８２． ［９］ＣｈｅｎＸＳ，ＧａｒｃｅａＲＬ，ＧｏｌｄｂｅｒｇＩ，ＣａｓｉｎｉＧ，Ｈａｒｒｉｓｏｎ ＳＣ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｓｍａｌｌｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓａｓｓｅｍｂｌｅｄ ｆｒｏｍｔｈｅＬ１ｐｒｏｔｅｉｎｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ１６［Ｊ］． ＭｏｌＣｅｌｌ，２０００，５（３）：５５７－５６７． ［１０］Ｗｏｌｆ Ｍ，ＧａｒｃｅａＲ Ｌ，ＧｒｉｇｏｒｉｅｆｆＮ，ＨａｒｒｉｓｏｎＳＣ． Ｓｕｂｕｎｉｔｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎｂｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ ＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，２０１０，１０７（１４）：６２９８－６３０３． ［１１］ＭａｃｈＨ，ＶｏｌｋｉｎＤＢ，ＴｒｏｕｔｍａｎＲ Ｄ，ＷａｎｇＢ，Ｌｕｏ Ｚ，ＪａｎｓｅｎＫ Ｕ，ＳｈｉＬ．Ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｒｅａｓｓｅｍｂｌｙｏｆ ｙｅａｓｔ－ｄｅｒｉｖｅｄｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｖｉｒｕｓ－ ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ（ＨＰＶＶＬＰｓ）［Ｊ］．ＪＰｈａｒｍＳｃｉ，２００６，９５ （１０）：２１９５－２２０６． ［１２］ＲｏｌｄａｏＡ，ＭｅｌｌａｄｏＭＣ，ＣａｓｔｉｌｈｏＬＲ，ＣａｒｒｏｎｄｏＭＪ， ＡｌｖｅｓＰＭ．Ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎｖａｃｃｉｎｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＶａｃｃｉｎｅｓ，２０１０，９（１０）：１１４９－１１７６． ［１３］ＢｕｏｎａｇｕｒｏＦ，ＢｕｏｎａｇｕｒｏＬ．Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｖｉｒｕｓ－ ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｔｏｈｕｍａｎｄｉｓｅａｓｅｓ［Ｊ］．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＶａｃ－ ｃｉｎｅｓ，２０１３，１２（２）：９９． ［１４］ＩｎｇｌｉｓＳ，Ｓｈａｗ Ａ，ＫｏｅｎｉｇＳ．Ｃｈａｐｔｅｒ１１：Ｈｐｖｖａｃ－ ｃｉｎｅｓ：Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｒｅｓｅａｒｃｈ ＆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｖａｃ－ ｃｉｎｅ，２００６，２４Ｓｕｐｐｌ２４（３）：９９－１０５． ［１５］ＫｉｒｎｂａｕｅｒＲ，ＢｏｏｙＦ，ＣｈｅｎｇＮ，ＬｏｗｙＤＲ，ＳｃｈｉｌｌｅｒＪ Ｔ．ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＬ１ｍａｊｏｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍ－ ｂｌｅｓｉｎｔｏｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｔｈａｔａｒｅｈｉｇｈｌｙｉｍｍｕｎｏ－ ｇｅｎｉｃ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９２，８９（２４）： １２１８０－１２１８４． ［１６］于 永 利．病毒样颗粒抗原 的表达、纯 化、组 装 和 鉴 定 ［Ｊ］．微生物学免疫学进展，２０１４，４２（１）：１－８． ［１７］ＨｏｆｍａｎｎＫＪ，ＣｏｏｋＪＣ，ＪｏｙｃｅＪＧ，ＢｒｏｗｎＤＲ，Ｓｃｈｕｌｔｚ ＬＤ，Ｇｅｏｒｇｅ ＨＡ，Ｒｏｓｏｌｏｗｓｋｙ Ｍ，Ｆｉｆｅ ＫＨ，Ｊａｎｓｅｎ ＫＵ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ６ａａｎｄａｓｓｅｍｂｌｙｏｆｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｎＳａｃｃｈａ－ ｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９５１；２０９（２）： ５０６－５１８． ［１８］ＬｉＭ，ＣｒｉｐｅＴＰ，ＥｓｔｅｓＰＡ，Ｌｙｏｎ Ｍ Ｋ，ＲｏｓｅＲＣ， ＧａｒｃｅａＲ Ｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ１１Ｌ１ｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ：Ｃｈａｒａｃ－ ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｄｏｍａｉｎｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎＤＮＡｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄｃａｐｓｉｄａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．ＪＶｉｒｏｌ，１９９７，７１（４）：２９８８－ ２９９５． ［１９］ＰａｉｎｔｓｉｌＪ，ＭｕｌｌｅｒＭ，ＰｉｃｋｅｎＭ，ＧｉｓｓｍａｎｎＬ，ＺｈｏｕＪ． Ｃａｒｂｏｘｙｌｔｅｒｍｉｎｕｓｏｆｂｏｖｉｎｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ－１Ｌ１ ｐｒｏｔｅｉｎｉｓｎｏｔｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｃａｐｓｉｄｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｖｉｒｏｌｏ－ ｇｙ，１９９６，２２３（１）：２３８－２４４． ［２０］ＣｈｅｎＹ，ＧｈｉｍＳＪ，ＪｅｎｓｏｎＡＢ，ＳｃｈｌｅｇｅｌＲ．Ｍｕｔａｎｔ ｃａｎｉｎｅｏｒａｌｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｌ１ｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｈｉｃｈ ｆｏｒｍｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓｂｕｔｌａｃｋｎａｔｉｖｅｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ［Ｊ］．ＪＧｅｎＶｉｒｏｌ，１９９８，７９（Ｐｔ９）：２１３７－２１４６． ［２１］ＶａｒｓａｎｉＡ，ＷｉｌｌｉａｍｓｏｎＡＬ，ＪａｆｆｅｒＭ Ａ，ＲｙｂｉｃｋｉＥＰ． Ａｄｅｌｅｔｉｏｎａｎｄｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆｔｈｅｈｕｍａｎｐａｐ－ ｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１６ｍａｊｏｒｃａｐｓｉｄｇｅｎｅ［Ｊ］．ＶｉｒｕｓＲｅｓ， ２００６，１２２（１－２）：１５４－１６３． ［２２］ＧａｒｃｅａＲＬ，ＳａｌｕｎｋｅＤ Ｍ，ＣａｓｐａｒＤＬ．Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎａｆｆｅｃｔｉｎｇｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓｃａｐｓｉｄｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ ｉｎｖｉｔｒｏ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８７，３２９（６１３４）：８６－８７． ［２３］ＳａｐｐＭ，ＶｏｌｐｅｒｓＣ，ＭｕｌｌｅｒＭ，ＳｔｒｅｅｃｋＲＥ．Ｏｒｇａｎｉ－ ｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍａｊｏｒａｎｄｍｉｎｏｒｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｔｙｐｅ３３ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅｓ［Ｊ］．ＪＧｅｎ Ｖｉｒｏｌ，１９９５，７６（Ｐｔ９）：２４０７－２４１２． ［２４］ＬｉＭ，ＢｅａｒｄＰ，ＥｓｔｅｓＰＡ，Ｌｙｏｎ Ｍ Ｋ，ＧａｒｃｅａＲＬ． Ｉｎｔｅｒｃａｐｓｏｍｅｒｉｃｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓｉｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓａｓ－ ｓｅｍｂｌｙａｎｄｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８，７２（３）： · ６５２ · 病 毒 学 报 ３４卷