四、构建cDNA文库 CDNA文库:以mRNA为模板在反转录酶的 作用下将形成的互补DNA(CDNA)建 立基因文库( gene library)
四、构建cDNA文库 cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的 作用下将形成的互补DNA（cDNA ）建 立基因文库（gene library）
特点: 1.cDNA无内含子,长度较基因组基因小,使操 作更为方便。 2.mRNA比基因组中基因少,因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。 3.mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数,利 于获得较多的模板。(转录特征) 4.可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5.不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 6.不能研究基因组的结构功能
特点： 1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操 作更为方便。 2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。 3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征） 4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA文库 1.制备mRNA 1)取材:mRNA约占总RNA的1-5%,所以应选 用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材 料来源,如获胰岛素基因,由应以胰岛β细胞 为原始生物材料,细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料 2)从总的RNA中分离mRNA 将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[ oligo(dT)]纤 维素中进行亲和层析
构建cDNA文库 1.制备mRNA 1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选 用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材 料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞 为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料 2)从总的RNA中分离mRNA 将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[ oligo(dT) ] 纤 维素中进行亲和层析
2.第一股cDNA合成 1)以Oigo(dT为引物:从模板3末端开始, 沿模板的33→5方向合成,对于较长的mRNA 分子很难得到全长cDNA 2)随机引物:以6~8个核苷酸为随机引物,从 mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链 (RNA-DNA) 3.第二股cDNA的合成
2.第一股 cDNA合成 1）以Oligo(dT) 为引物：从模板3’末端开始， 沿模板的3’→5’方向合成, 对于较长的mRNA 分子很难得到全长cDNA 2）随机引物：以6～8个核苷酸为随机引物，从 mRNA的不同结合点合成全长cDNA第一链 （RNA-DNA） 3.第二股cDNA的合成
mrNA 双链质粒DNA 3AAAAAA 把 Omigod引物 加到PoyA)尾巴 AAAAA PBR322 TIT 反转录酵 (1)自身引导法: 限制酶 用NaOH降解nRNA (2)置换合成法 链,DNA聚合酶以发夹坏 作引物合成互补DNA链 (3)外加引物合成法 未端转移 S核酸酶S|核酸酶 4.cDNA与载体连接和 E, dGTP 解发夹结构 导入宿主细胞 末端转移 酶,dCTP (如图45) CCc 插入质粒载体 转化给大肠杆菌,扩增 图45cDNA的合成和克隆
⑴ 自身引导法： ⑵ 置换合成法 ⑶ 外加引物合成法 4.cDNA与载体连接和 导入宿主细胞 (如图4-5)