2构建基因组文库全过程(DNA重组的过程) (1)分离纯化基因组DNA 提取哺乳动物细胞染色体DNA (2)制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端,因此插入 载体之前还需要进行修饰加工,少用 ②限制性内切酶降解(鸟枪法) 过去用 ECoR I,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直接与 处理过的载体连接
2.构建基因组文库全过程(DNA重组的过程 ) ⑴ 分离纯化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入 载体之前还需要进行修饰加工,少用 ②限制性内切酶降解(鸟枪法) 过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端,可以直接与 处理过的载体连接
(3)DNA片断与载体的连接包装 常用载体:粘性质粒λ噬菌体 酵母人工染色体 ①基因组DNA+粘性质粒—重组DNA 转化细菌菌落 ②基因组DNA+λ噬菌体—重组DNA 包装成噬菌体——感染细菌—噬菌斑 1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆 群体就包含基因组的全部基因片段总和
• ⑶ DNA片断与载体的连接包装 • 常用载体:粘性质粒 λ噬菌体 • 酵母人工染色体 • ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA— —转化细菌 菌落 • ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA— 包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 • 1个克隆含有基因组的某个片段,整个克隆 群体就包含基因组的全部基因片段总和
基因组文库大小的计算 1975年 L. Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重 组体所需实际克隆数(N)的公式: In(1-P) N In(1-f P为在基因组文库目的基因出现的几率(一般为99%);f为 插入的限制片断长度/整个基因组DNA总长度。 例如:从人基因组DNA(总长度为3×10%bp)的文库中筛选 到长约1.5kb目的基因的可能性为99%,那么这个基因组文 库要多大? In(1-0.99) N 9.2×106 In(1-1.5×103/3×109)
基因组文库大小的计算 1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重 组体所需实际克隆数( N )的公式: In(1-P) N = ——————— In (1-f) P为在基因组文库目的基因出现的几率(一般为99%);f为 插入的限制片断长度/整个基因组DNA总长度。 例如:从人基因组DNA(总长度为3×109bp)的文库中筛选 到长约1.5kb目的基因的可能性为99%,那么这个基因组文 库要多大? In(1-0.99) N = ——————————————— = 9.2×106 In (1-1.5×103/3×109)
若用质粒(pBR322)克隆目的基因(1.5kb) 需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA 序列;若用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因 的人基因组DNA文库,按上式计算所需要的重 组体克隆数可以减少到9×105,而要用柯斯质粒 将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降 到3.5×105左右均可满足建库要求 表4-1三种常用基因组文库克隆载体的比较 载体种类 装载量 转染率 λ噬菌体 9~22kb 105~10转化子/gDNA 粘性质粒 Cosmid)30~4kb10+~10转化子/gDNA 酵母人工染色体 100~1000kb 500转化子/ HgDNA (YAC)
• 若用质粒(pBR322)克隆目的基因(1.5kb) 需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA 序列;若 用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因 的人基因组DNA文库,按上式计算所需要的重 组体克隆数可以减少到9×105 , 而要用柯斯质粒 将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降 到3.5×105左右,均可满足建库要求。 载体种类 装载量 转 染 率 λ噬菌体 粘性质粒 (Cosmid) 酵母人工染色体 (YAC) 9~22kb 30~45kb 100~1000kb 105~106转化子/μgDNA 104~106转化子/μgDNA ~500转化子/μgDNA 表4-1 三种常用基因组文库克隆载体的比较