硝酸汞电位 铂-汞-硫酸亚汞 铂电极可用10%(g/ml)硫代硫酸 滴定法 钠溶液浸泡后用水清洗。汞-硫 酸亚汞电极可 用稀硝酸浸泡后用 水清洗 永停法 铂-铂 铂 电极用加有少量三氯化铁的硝 酸或用铬酸清洁液浸洗 滴定法(1)电位滴定法将盛有供试品溶液的烧杯置电磁搅拌器上,浸 入电极,搅拌,并自滴定管中分次滴加滴定液:开始时可每次加入较多的 量,搅拌,记录电位:至将近终点前,则应每次加入少量,搅拌,记录电 位:至突跃点已过,仍应继续滴加几次滴定液,并记录电位 滴定终点的确定用坐标纸以电位(E)为纵坐标,以滴定液体积(V) 为横坐标,绘制E一V曲线,以此曲线的陡然上升或下降部分的中心为滴定 终点。或以△E/△V(即相邻两次的电位差和加入滴定液的体积差之比)为 纵坐标,以滴定液体积(V)为横坐标,绘制(△E/△V)-V曲线,与△E/△V 的极大值对应的体积即为滴定终点。也可采用二阶导数确定终点。根据求 得的△E/△值,计算相邻数值间的差值,即为△<2>E/△V<2>,绘制 (△<2E/△V<2>)一V曲线,曲线过零时的体积即为滴定终点 如系供指示剂变色域的选择核对,滴定前加入指示剂,观察终点前至 终点后的颜色变化,以选定该品种终点时的指示剂颜色。 (2)永停滴定法用作重氮化法的终点指示时,调节R<[]>使加于电极上的 电压约为50mV。取供试品适量,精密称定,置烧杯中,除另有规定外,可 加水4oml与盐酸溶液(1→2)l5m,而后置电磁搅拌器上,搅拌使溶解,再加溴 化钾2g,插入铂-铂电极后,将滴定管的尖端插入液面下约2/3处,用亚硝酸 钠滴定液(0.lmoL或0.05mol/)迅速滴定,随滴随搅拌,至近终点时,将滴定 管的尖端提出液面,用少量水淋洗尖端,洗液并入溶液中,继续缓缓滴定 至电流计指针突然偏转,并不再回复,即为滴定终点。 用作水分测定的终点指示时,可调节R<[1]>使电流计的初始电流为 5~10μA,待滴定到电流突增至50~150μA,并持续数分钟不退回,即为滴定 终点。 电泳法(2005年版二部) 附录VF 电泳法 电泳法是指带电荷的供试品(蛋白质、核苷酸等)在惰性支持介质(如 纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等)中,在电场的作用下
硝酸汞电位 铂-汞-硫酸亚汞 铂电极可用 10％(g／ml)硫代硫酸 滴定法 钠溶液浸泡后用水清洗。汞-硫 酸亚汞电极可 用稀硝酸浸泡后用 水清洗。 ────────────────────────────────────── ─────────────────── 永停法 铂-铂 铂 电极用加有少量三氯化铁的硝 酸或用铬酸清洁液浸洗 ────────────────────────────────────── ─────────────────── 滴定法 (1)电位滴定法 将盛有供试品溶液的烧杯置电磁搅拌器上，浸 入电极，搅拌，并自滴定管中分次滴加滴定液；开始时可每次加入较多的 量，搅拌，记录电位；至将近终点前，则应每次加入少量，搅拌，记录电 位；至突跃点已过，仍应继续滴加几次滴定液，并记录电位。 滴定终点的确定 用坐标纸以电位（E）为纵坐标，以滴定液体积（V） 为横坐标，绘制 E－V 曲线，以此曲线的陡然上升或下降部分的中心为滴定 终点。或以△E／△V（即相邻两次的电位差和加入滴定液的体积差之比）为 纵坐标，以滴定液体积(V)为横坐标，绘制（△E／△V）-V 曲线，与△E／△V 的极大值对应的体积即为滴定终点。也可采用二阶导数确定终点。根据求 得的△E／△V 值，计算相邻数值间的差值，即为△<2>E／△V<2>，绘制 （△<2>E／△V<2>）－V 曲线，曲线过零时的体积即为滴定终点。 如系供指示剂变色域的选择核对，滴定前加入指示剂，观察终点前至 终点后的颜色变化，以选定该品种终点时的指示剂颜色。 (2)永停滴定法 用作重氮化法的终点指示时,调节 R<[1]>使加于电极上的 电压约为 50mV。取供试品适量，精密称定，置烧杯中，除另有规定外，可 加水 40ml 与盐酸溶液(1→2)15ml，而后置电磁搅拌器上，搅拌使溶解，再加溴 化钾 2g，插入铂-铂电极后，将滴定管的尖端插入液面下约 2/3 处，用亚硝酸 钠滴定液(0.1mol/L 或 0.05mol/L)迅速滴定，随滴随搅拌，至近终点时，将滴定 管的尖端提出液面，用少量水淋洗尖端，洗液并入溶液中，继续缓缓滴定， 至电流计指针突然偏转，并不再回复，即为滴定终点。 用作水分测定的终点指示时，可调节 R<[1]>使电流计的初始电流为 5～10μA，待滴定到电流突增至 50～150μA，并持续数分钟不退回，即为滴定 终点。 电泳法（2005 年版二部） 附录Ⅴ F 电泳法 电泳法是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如 纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，在电场的作用下
向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动,使组分分离成狭窄的区带,用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。 各电泳法,除另有规定外,照下述方法操作。 第一法纸电泳法 1.仪器装置包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图(图略),包括两个电泳槽A和一个可以密 封的玻璃(或相应材料)盖B;两侧的电泳槽均用有机玻璃(或相应材料)板C 分成两部分:外格装有铂电极(直径0.5~0.8cm)D:里格为可放滤纸E的有机玻 璃电泳槽架F,此架可从槽中取出:两侧电泳槽A内的铂电极D经隔离导线穿 过槽壁与外接电泳仪电源相连 电源为具有稳压器的直流电源,常压电泳一般在100~500V,高压电泳一 般在500~10000V 2.操作法(1)电泳缓冲液枸橼酸盐缓冲液φpH3.0)。取枸橼酸 (C6H8O7·H2O 3904g与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H04.12g,加水4000m,使溶解 (2)滤纸取色谱滤纸置1molL甲酸溶液中浸泡过夜,次日取出,用水漂洗 至洗液的pH值不低于4,置60℃烘箱烘干,备用。可按需要裁成长27cm、宽l8cm 的滤纸,或根据电泳室的大小裁剪,并在距长度方向一端5~8cm处划一起始 线,每隔25~3cm处做一记号备点样用。 (3)点样有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐 缓冲液(pHB30)中,湿润后,取出,用滤纸吸干多余的缓冲液,置电泳槽架上, 使起始线靠近阴极端,将滤纸两端浸λ缓冲液中,然后用微量注射器精密 点加供试品溶液,每点10μl,共3点,并留2个空白位置 干点法是将供试品溶液点于滤纸上,吹干、再点,反复数次,直至点 完规定量的供试品溶液,然后用喷雾器将滤纸喷湿,点样处最后喷湿,本 法适用于稀的供试品溶液 4)电泳于电泳槽中加入适量电泳缓冲液浸没铂电极,接通电泳仪稳 压电源档,调整电压梯度为18~20V/cm,电泳约1小时45分钟,取出,立即吹 干,置紫外光灯(254nm)下检视,用铅笔划出紫色斑点的位置。 (5)含量测定剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸,剪 成细条,分别置试管中,各精密加入00lmol/L盐酸溶液5ml,摇匀,放置1小 时,用3号垂熔玻璃漏斗滤过,也可用自然沉降或离心法倾取上清液,按各 药品项下的规定测定吸收度,并按吸收系数计算含量。 第二法醋酸纤维素薄膜电泳法 1.仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳。 2试剂(1)巴比妥缓冲液(pH86)取巴比妥276g、巴比妥钠1545g,加水 溶解 使成1000ml。 (2)氨基黑染色液取0.5g的氨基黑10B溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水4ml 混合液中。 (3)漂洗液取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml,混匀 (4)透明液取冰醋酸25ml,加无水乙醇75ml,混匀。 3操作法(1)醋酸纤维素薄膜取醋酸纤维素薄膜,裁成2cm×8cm的膜条
向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用 适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。 各电泳法，除另有规定外，照下述方法操作。 第一法 纸电泳法 1.仪器装置 包括电泳室及直流电源两部分。 常用的水平式电泳室装置如图(图略)，包括两个电泳槽 A 和一个可以密 封的玻璃(或相应材料)盖 B；两侧的电泳槽均用有机玻璃（或相应材料）板 C 分成两部分；外格装有铂电极(直径 0.5～0.8cm)D；里格为可放滤纸 E 的有机玻 璃电泳槽架 F，此架可从槽中取出；两侧电泳槽 A 内的铂电极 D 经隔离导线穿 过槽壁与外接电泳仪电源相连。 电源为具有稳压器的直流电源，常压电泳一般在 100～500V，高压电泳一 般在 500～10 000V。 2. 操作法 (1) 电泳缓冲液 枸橼酸盐缓冲液 (pH3.0) 。取枸橼酸 (C6H8O7·H2O) 39.04g 与枸橼酸钠(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水 4000ml，使溶解。 (2) 滤纸 取色谱滤纸置 1mol/L 甲酸溶液中浸泡过夜，次日取出，用水漂洗 至洗液的 pH 值不低于 4,置 60℃烘箱烘干，备用。可按需要裁成长 27cm、宽 18cm 的滤纸，或根据电泳室的大小裁剪，并在距长度方向一端 5～8cm 处划一起始 线，每隔 2.5～3cm 处做一记号备点样用。 (3) 点样 有湿点法和干点法。湿点法是将裁好的滤纸全部浸入枸橼酸盐 缓冲液(pH3.0)中，湿润后，取出，用滤纸吸干多余的缓冲液，置电泳槽架上， 使起始线靠近阴极端，将滤纸两端浸入缓冲液中，然后用微量注射器精密 点加供试品溶液，每点 10μl，共 3 点，并留 2 个空白位置。 干点法是将供试品溶液点于滤纸上，吹干、再点，反复数次，直至点 完规定量的供试品溶液，然后用喷雾器将滤纸喷湿，点样处最后喷湿，本 法适用于稀的供试品溶液。 (4) 电泳 于电泳槽中加入适量电泳缓冲液,浸没铂电极，接通电泳仪稳 压电源档，调整电压梯度为 18～20V/cm，电泳约 1 小时 45 分钟，取出,立即吹 干，置紫外光灯(254nm)下检视，用铅笔划出紫色斑点的位置。 (5) 含量测定 剪下供试品斑点和与斑点位置面积相近的空白滤纸，剪 成细条，分别置试管中，各精密加入 0.01mol/L 盐酸溶液 5ml，摇匀，放置 1 小 时，用 3 号垂熔玻璃漏斗滤过，也可用自然沉降或离心法倾取上清液，按各 药品项下的规定测定吸收度，并按吸收系数计算含量。 第二法 醋酸纤维素薄膜电泳法 1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。 2.试剂 (1) 巴比妥缓冲液(pH8.6) 取巴比妥 2.76g、巴比妥钠 15.45g，加水 溶解 使成 1000ml。 (2) 氨基黑染色液 取0.5g的氨基黑10B,溶于甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml 的 混合液中。 (3) 漂洗液 取乙醇 45ml、冰醋酸 5ml 及水 50ml，混匀。 (4) 透明液 取冰醋酸 25ml，加无水乙醇 75ml，混匀。 3.操作法 (1) 醋酸纤维素薄膜 取醋酸纤维素薄膜，裁成 2cm×8cm 的膜条
将无光泽面向下,浸入巴比妥缓冲液(pH86)中,待完全浸透,取出夹于滤纸 中,轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥 浸入巴比妥缓冲液(pH86中。 (2)点样与电泳于膜条上距负极端2cm处,条状滴加蛋白含量约5%的供 试品溶液2~3μl,在10~12v/cm电位梯度下电泳。电泳区带距离以4~5cm为宜 (3)染色电泳完毕,将膜条取下浸于氨基黑染色液中,2~3分钟后,用 漂洗液浸洗数次,直至脱去底色为止 (4)透明将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中10~15分钟,取出平铺 于洁净的玻板上,干后即成透明薄膜,可于分光光度计上测定和作标本长 期保存。 (5)含量测定未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规 定的方法测定,一般采用洗脱法或扫描法,测定各蛋白质组分的相对含量 (1%)。 洗脱法将洗净的膜条用滤纸吸干,剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳 区带,分别浸于1.6%的氢氧化钠溶液中,振摇数次,至洗脱完全,于一定 波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位,同法操作 作对照。先计算吸收值总和,再计算各蛋白组分所占比率(%)。 扫描法将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射(未透明薄 膜)或透射(已透明薄膜)方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图, 横坐标为膜条的长度,纵坐标为吸收度,计算各蛋白组分的含量(%)。亦可 用微机处理积分计算。 第三法琼脂糖凝胶电泳法 1.仪器装置电泳室及直流电源同纸电泳 2试剂(1)醋酸一锂盐缓冲液(pH30)取冰醋酸50ml,加水800m混合后 用 氢氧化锂调节pH值至30,再加水至100mnl (2)甲苯胺蓝溶液取甲苯胺蓝0.lg,加水l0oml使溶解。 3操作法(1)制胶取琼脂糖约0.2g,加水10ml,置水浴中加热使溶胀完全, 加温热的醋酸一锂盐缓冲液(φpH3.O)loml,混匀,趁热将胶液涂布于大小适宜 (2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻板上,厚度约3mm,静置,待凝胶结成无气泡的均 匀薄层,即得。 (2)标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下规定配制。 (3)点样与电泳在电泳槽内加入醋酸一锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于 电泳槽架上,经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μ,立即接 通电源,在电压梯度约30Vcm、电流强度1~2mA/cm的条件下,电泳约20分 钟,关闭电源。 (4)染色与脱色取下凝胶板,用甲苯胺蓝溶液染色,用水洗去多余的 染色液至背景无色为止 第四法聚丙烯酰胺凝胶电泳法 1仪器装置通常由稳流电泳仪和圆盘电泳槽或平板电泳槽组成。其电 泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极,铂电极经隔离电线接于电 泳仪稳流挡上。 2试剂(1)溶液A取三羟甲基氨基甲烷36.6g,四甲基乙二胺023ml加 Imol/L
将无光泽面向下，浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夹于滤纸 中，轻轻吸去多余的缓冲液后,将膜条无光泽面向上,置电泳槽架上,经滤纸桥 浸入巴比妥缓冲液(pH8.6)中。 (2) 点样与电泳 于膜条上距负极端 2cm 处，条状滴加蛋白含量约 5％的供 试品溶液 2～3μl，在 10～12V/cm 电位梯度下电泳。电泳区带距离以 4～5cm 为宜。 (3) 染色 电泳完毕，将膜条取下浸于氨基黑染色液中，2～3 分钟后，用 漂洗液浸洗数次，直至脱去底色为止。 (4) 透明 将洗净并完全干后的膜条浸于透明液中 10～15 分钟，取出平铺 于洁净的玻板上，干后即成透明薄膜，可于分光光度计上测定和作标本长 期保存。 (5) 含量测定 未经透明处理的醋酸纤维素薄膜电泳图可按各药品项下规 定的方法测定，一般采用洗脱法或扫描法，测定各蛋白质组分的相对含量 (1%)。 洗脱法 将洗净的膜条用滤纸吸干，剪下供试品溶液各电泳图谱的电泳 区带，分别浸于 1.6％的氢氧化钠溶液中，振摇数次，至洗脱完全， 于一定 波长下测定吸收度。同时剪取与供试品膜条相应的无蛋白部位，同法操作 作对照。先计算吸收值总和，再计算各蛋白组分所占比率(%)。 扫描法 将干燥的醋酸纤维素薄膜用色谱扫描仪通过反射 （未透明薄 膜） 或透射（已透明薄膜）方式在记录器上自动绘出各蛋白组分曲线图， 横坐标为膜条的长度，纵坐标为吸收度，计算各蛋白组分的含量(%)。亦可 用微机处理积分计算。 第三法 琼脂糖凝胶电泳法 1.仪器装置 电泳室及直流电源同纸电泳。 2.试剂 (1) 醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0) 取冰醋酸 50ml，加水 800ml 混合后， 用 氢氧化锂调节 pH 值至 3.0，再加水至 1000ml。 (2) 甲苯胺蓝溶液 取甲苯胺蓝 0.1g，加水 100ml 使溶解。 3.操作法 (1)制胶 取琼脂糖约 0.2g，加水 10ml，置水浴中加热使溶胀完全， 加温热的醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0)10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜 (2.5cm×7.5cm 或 4cm×9cm)的玻板上，厚度约 3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均 匀薄层，即得。 (2) 标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下规定配制。 (3) 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸－锂盐缓冲液(pH3.0),将凝胶板置于 电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样 1μl，立即接 通电源，在电压梯度约 30V/cm、电流强度 1～2mA/cm 的条件下，电泳约 20 分 钟，关闭电源。 (4) 染色与脱色 取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的 染色液至背景无色为止。 第四法 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 1.仪器装置 通常由稳流电泳仪和圆盘电泳槽或平板电泳槽组成。其电 泳室有上、下两槽,每个槽中都有固定的铂电极，铂电极经隔离电线接于电 泳仪稳流挡上。 2.试剂 (1)溶液 A 取三羟甲基氨基甲烷 36.6g，四甲基乙二胺 0.23ml,加 1mol/L
盐酸溶液48ml,再加水溶解并稀释至00m,置棕色瓶内,在冰箱中保存 (2)溶液B取丙烯酰胺30.0g、次甲基双丙烯酰胺0.74g,加水溶解并稀释至 l00ml,滤过,置棕色瓶内,在冰箱中保存。 (3)电极缓冲液(pH8.3)取三羟甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解并稀 释至1000ml,置冰箱中保存,用前稀释10倍 (4)溴酚蓝指示液取溴酚蓝0.1g,加005moL氢氧化钠溶液3.0m与90%乙醇 5ml, 微热使溶解,加20%乙醇制成250ml。 (5)染色液取0.25%(g/m)考马斯亮蓝G<[250]>溶液2ml,加12.5%(gml)三 氯醋 酸溶液至10ml (6)稀染色液取上述染色液2ml,加12.5%(g/m)三氯醋酸溶液至loml (7)脱色液7%醋酸溶液 3操作法(1)制胶取溶液A2m,溶液B54ml,加脲2.gg使溶解,再加水4ml, 混匀,抽气赶去溶液中气泡,加0.56%过硫酸铵溶液2m,混匀制成胶液,立 即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻 璃管(10cm×0.5cm)中,使胶层高度达6~πcm,然后徐徐滴加水少量,使覆盖胶 面,管底气泡必须赶走,静置约30分钟,待出现明显界面时即聚合完毕 吸去水层 (2)标准品溶液及供试品溶液的制备照各药品项下的规定。 (3)电泳将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内,每管加供试品或标 准品溶液50~100μl,为防止扩散可加甘油或40%蔗糖溶液1~2滴及004%溴酚 蓝指示液1滴,也可直接在上槽缓冲液中加θ.04%溴酚蓝指示液数滴,玻璃 管的上部用电极缓冲液充满,上端接负极、下端接正极。调节起始电流使 每管为lmA,数分钟后,加大电流使每管为2~3mA,当溴酚蓝指示液移至距 玻璃管底部lcm处,关闭电源。 4)染色和脱色电泳完毕,用装有长针头并吸满水的注射器自胶管底部 沿胶管壁将水压入,胶条即从管内滑出,将胶条浸入稀染色液过夜或用染 色液浸泡10~30分钟,以水漂洗干净,再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的 底色透明为止 (5)结果判断将胶条置灯下观察,根据供试品与标准品的色带位置和色 泽深浅程度进行判断 相对迁移率供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R※<m]>)进 行比较。其计算式如下: 进胶端到供试品或标 准品区带的距离 相对迁移率(R※<[m})= 进胶 端到溴酚蓝区带的距离 扫描将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并 积分,由各组分的峰面积计算含量(1%)。 第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白的原理是根据大多数蛋白都能与阴
盐酸溶液 48ml，再加水溶解并稀释至 100ml,置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (2)溶液 B 取丙烯酰胺 30.0g、次甲基双丙烯酰胺 0.74g，加水溶解并稀释至 100ml，滤过，置棕色瓶内，在冰箱中保存。 (3)电极缓冲液(pH8.3) 取三羟甲基氨基甲烷 6g、甘氨酸 28.8g,加水溶解并稀 释至 1000ml，置冰箱中保存，用前稀释 10 倍。 (4)溴酚蓝指示液 取溴酚蓝 0.1g,加 0.05mol/L 氢氧化钠溶液 3.0ml 与 90％乙醇 5ml， 微热使溶解，加 20％乙醇制成 250ml。 (5)染色液 取 0.25％(g/ml)考马斯亮蓝 G<[250]>溶液 2.5ml，加 12.5％(g/ml)三 氯醋 酸溶液至 10ml。 (6)稀染色液 取上述染色液 2ml，加 12.5％(g/ml)三氯醋酸溶液至 10ml。 (7)脱色液 7％醋酸溶液。 3.操作法 (1)制胶 取溶液 A2ml，溶液 B5.4ml，加脲 2.9g 使溶解，再加水 4ml， 混匀，抽气赶去溶液中气泡，加 0.56％过硫酸铵溶液 2ml，混匀制成胶液，立 即用装有长针头的注射器或细滴管将胶液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻 璃管(10cm×0.5cm)中，使胶层高度达 6～7cm, 然后徐徐滴加水少量，使覆盖胶 面，管底气泡必须赶走，静置约 30 分钟，待出现明显界面时即聚合完毕， 吸去水层。 (2)标准品溶液及供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。 (3)电泳 将已制好的凝胶玻璃管装入圆盘电泳槽内，每管加供试品或标 准品溶液 50～100μl，为防止扩散可加甘油或 40％蔗糖溶液 1～2 滴及 0.04％溴酚 蓝指示液 1 滴，也可直接在上槽缓冲液中加 0.04％溴酚蓝指示液数滴，玻璃 管的上部用电极缓冲液充满，上端接负极、下端接正极。调节起始电流使 每管为 1mA，数分钟后，加大电流使每管为 2～3mA，当溴酚蓝指示液移至距 玻璃管底部 1cm 处，关闭电源。 (4)染色和脱色 电泳完毕，用装有长针头并吸满水的注射器,自胶管底部 沿胶管壁将水压入，胶条即从管内滑出，将胶条浸入稀染色液过夜或用染 色液浸泡 10～30 分钟，以水漂洗干净，再用脱色液脱色至无蛋白区带凝胶的 底色透明为止。 (5)结果判断 将胶条置灯下观察，根据供试品与标准品的色带位置和色 泽深浅程度进行判断。 相对迁移率 供试品和标准品的电泳区带有时可用相对迁移率(R※<[m]>)进 行比较。其计算式如下： 进胶端到供试品或标 准品区带的距离 相对迁移率(R※<[m]>)＝─────────────────────── ──────── 进胶 端到溴酚蓝区带的距离 扫描 将清晰的胶条置双波长薄层扫描仪或凝胶电泳扫描仪中扫描并 积分，由各组分的峰面积计算含量(1%)。 第五法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白的原理是根据大多数蛋白都能与阴
离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(〈SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所 带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷,消除了不同蛋白分子的电荷 效应,使蛋白按分子大小分离 1仪器装置恒压或恒流电源、垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。 2试剂(1)30%丙烯酰胺溶液取丙烯酰胺60g与亚甲基双丙烯酰胺1.6g, 水至200ml,滤纸滤过,避光保存。 (2)分离胶缓冲液取三羟甲基氨基甲烷36.3g、加水70ml,用盐酸调节pH值 至8.8,加水至100m。 (3)浓缩胶缓冲液取三羟甲基氨基甲烷6.0g、加水70ml,用盐酸调节pH值 至6.8,加水至100ml (4)电泳缓冲液取三羟甲基氨基甲烷60g、甘氨酸288g、十二烷基硫酸钠 1.0g,加水至1000ml 3.操作法 (1)制胶用30%丙烯酰胺溶液一分离胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶 液一10%过硫酸铵溶液(新鲜配制)-四甲基乙二胺-水 (50:1.5:0.08:0.1:0.01:53)制成分离胶液,灌入模具内至一定高度(剩余 体积留作制备浓缩胶用),用水封顶,聚合完毕,倾去水层。再用30%丙烯 酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10%过硫酸铵溶液-四甲基 乙二胺-水(0.8:1.3:0.025:0.05:0.005:24)制成浓缩胶液,灌在分离胶上,插 入样品梳(如为圆盘电泳,用水封顶),待浓缩胶液聚合后,小心除去样 品梳或水。 (2)对照品和供试品溶液的制备照各药品项下的规定。 (3)电泳垂直板电泳:恒压电泳,初始电压为80V,进入分离胶时调至 150~200V,当溴酚蓝迁移胶底处,停止电泳。 圆盘电泳:调节电流使每管8mA 4.固定与染色 (1)考马斯亮蓝染色 ①试剂a固定液称取三氯醋酸5g,加水200ml溶解后,加甲醇200ml 再 加水至500ml b染色液称取考马斯亮蓝R<[250>05g,加水200ml溶 解后,加甲 醇200ml与冰醋酸50ml,再加水至500ml。 c.脱色液取甲醇400ml、冰醋酸100ml,加水至1000ml 充分混合 d保存液取冰醋酸75ml,加水至1000m,摇匀 ②固定与染色电泳完毕,取出胶片(条),置固定液中30分钟,取出 胶片(条),置染色液中1~2小时,用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在 保存液中。 ①试剂a硝酸银溶液取硝酸银0.8g,加水至40ml,将此溶液滴加到 0.lmol/L氢氧化钠溶液20ml与25%氨溶液15ml的混合液中,摇匀,用水稀释至 l00ml。 b.固定液取甲醇50ml、37%甲醛溶液54μl,加水至
离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS)按重量比结合成复合物,使蛋白分子所 带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白分子的电荷 效应,使蛋白按分子大小分离。 1.仪器装置 恒压或恒流电源、垂直板或圆盘电泳槽和制胶模具。 2.试剂 (1)30%丙烯酰胺溶液 取丙烯酰胺 60g 与亚甲基双丙烯酰胺 1.6g，加 水至 200ml，滤纸滤过，避光保存。 (2)分离胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷 36.3g、加水 70ml，用盐酸调节 pH 值 至 8.8，加水至 100ml。 (3)浓缩胶缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷 6.0g、加水 70ml，用盐酸调节 pH 值 至 6.8，加水至 100ml。 (4)电泳缓冲液 取三羟甲基氨基甲烷 6.0g、甘氨酸 28.8g、十二烷基硫酸钠 1.0g，加水至 1000ml。 3.操作法 (1)制胶 用 30%丙烯酰胺溶液－分离胶缓冲液－20%十二烷基硫酸钠溶 液－10％过硫酸铵溶液（新鲜配制）-四甲基乙二胺-水 (5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)制成分离胶液，灌入模具内至一定高度（剩余 体积留作制备浓缩胶用），用水封顶，聚合完毕，倾去水层。再用 30%丙烯 酰胺溶液-浓缩胶缓冲液-20%十二烷基硫酸钠溶液-10％过硫酸铵溶液-四甲基 乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)制成浓缩胶液，灌在分离胶上，插 入样品梳（如为圆盘电泳，用水封顶），待浓缩胶液聚合后，小心除去样 品梳或水。 (2)对照品和供试品溶液的制备 照各药品项下的规定。 (3)电泳 垂直板电泳：恒压电泳，初始电压为 80V，进入分离胶时调至 150～200V，当溴酚蓝迁移胶底处，停止电泳。 圆盘电泳：调节电流使每管 8mA。 4.固定与染色 (1)考马斯亮蓝染色 ①试剂 a.固定液 称取三氯醋酸 5g，加水 200ml 溶解后，加甲醇 200ml， 再 加水至 500ml。 b.染色液 称取考马斯亮蓝 R<[250]>0.5g，加水 200ml 溶 解后，加甲 醇 200ml 与冰醋酸 50ml，再加水至 500ml。 c.脱色液 取甲醇 400ml、冰醋酸 100ml，加水至 1000ml， 充分混合。 d.保存液 取冰醋酸 75ml，加水至 1000ml，摇匀。 ②固定与染色 电泳完毕，取出胶片（条），置固定液中 30 分钟，取出 胶片（条），置染色液中 1～2 小时，用脱色液脱色至凝胶背景透明后保存在 保存液中。 (2)银染色 ①试剂 a.硝酸银溶液 取硝酸银 0.8g，加水至 4.0ml，将此溶液滴加到 0.1mol/L 氢氧化钠溶液 20ml 与 25%氨溶液 1.5ml 的混合液中，摇匀，用水稀释至 100ml。 b.固定液 取甲醇 50ml、37%甲醛溶液 54μl，加水至