GB4789.10-2010 5.2.1将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h~24h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长，污染严重时在10%氯化钠肤酪陈大豆肉汤内呈混浊生长。 5.2.2将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36C±1℃培养18h~24h Baird-Parker平板36C±1℃培养18h~24h或45h~48h。 5.2.3金黄色葡萄球菌在Baird--Parker平板上，菌落直径为2mm~3mm,颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇 到非脂肪溶解的类似菌落：但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的茵落比典型菌 落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固 酶试验。 5.3鉴定 5.3.1染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为 0.5um-1um。 5.3.2血浆凝固酶试验：挑取、Baird-.Parker平板或血平板上可疑菌落1个或以上，分别接种到5mLBH 和营养球脂小斜面，36C±1℃培养18h~24h。 取新鲜配置兔血浆0.5mL,放入小试管中，再加入BH培养物0.2mL~0.3mL,振荡摇匀，置36 ℃士1℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6h,如呈现凝周（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝 块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌 株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mLBH,36℃±1℃培养18h~48h,重复试验， 5.4葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌 肠毒素。 6结果与报告 6.1结果判定：符合523、5.3，可判定为金黄色葡萄球南。 6.2结果报告：在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄球茵
GB 4789.10—2010 4 5.2.1 将上述样品匀液于 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。金黄色葡萄球菌在 7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长，污染严重时在 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。 5.2.2 将上述培养物，分别划线接种到 Baird-Parker 平板和血平板，血平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h。 Baird-Parker 平板 36 ℃±1 ℃培养 18 h～24 h 或 45 h～48 h。 5.2.3 金黄色葡萄球菌在 Baird-Parker 平板上，菌落直径为 2 mm～3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为 淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇 到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌 落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、 金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。挑取上述菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固 酶试验。 5.3 鉴定 5.3.1 染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为 0.5 μm～1 μm。 5.3.2 血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落 1 个或以上，分别接种到 5 mL BHI 和营养琼脂小斜面，36 ±1 ℃ ℃培养 18 h～24 h。 取新鲜配置兔血浆 0.5 mL，放入小试管中，再加入 BHI 培养物 0.2 mL～0.3 mL，振荡摇匀，置 36 ℃ ℃ ±1 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察 6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝 块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌 株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。 结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到 5 mL BHI，36 ±1 ℃ ℃培养 18 h～48 h，重复试验。 5.4 葡萄球菌肠毒素的检验 可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌 肠毒素。 6 结果与报告 6.1 结果判定：符合 5.2.3、5.3，可判定为金黄色葡萄球菌。 6.2 结果报告：在 25 g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌
GB4789.10-2010 第二法金黄色葡萄球菌Baird--Parker平板计数 7检验程序 金黄色葡萄球菌平板计数程序见图2 检样 25gmL)样品+225ml稀释液，均质 10倍系列稀释 选择2个一3个连续的适宜稀释度的样品匀液，接种Bard.Parker平板 36℃±1℃ 45h48h 计数及血浆凝固酶试验 报告☐ 图2金黄色葡萄球菌Baird--Parker平板法检验程序 8操作步躁 8.1样品的稀释 8.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 min~10000min均质1min一2min,或置盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2min,制成1：10的样品匀液 8.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶 内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 8.1.3用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1：10样品匀液1mL,沿管壁缓慢注于盛有9mL稀释液的无 茵试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打使 其混合均匀，制成1：100的样品匀液。 8.1.4按8.13操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管或 吸头。 82样品的接种 根据对样品污染状况的估计，选择2个一3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在 进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1mL样品匀液以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加 5
GB 4789.10—2010 5 36 ℃±1 ℃ 第二法 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker平板计数 7 检验程序 金黄色葡萄球菌平板计数程序见图2。 图 2 金黄色葡萄球菌 Baird-Parker 平板法检验程序 8 操作步骤 8.1 样品的稀释 8.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min，或置盛有225 mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。 8.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶 内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。 8.1.3 用 1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取 1:10 样品匀液 1 mL，沿管壁缓慢注于盛有 9 mL 稀释液的无 菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用 1 支 1 mL 无菌吸管反复吹打使 其混合均匀，制成 1:100 的样品匀液。 8.1.4 按 8.1.3 操作程序，制备 10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用 1 次 1 mL 无菌吸管或 吸头。 8.2 样品的接种 根据对样品污染状况的估计，选择 2 个～3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在 进行 10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取 1 mL 样品匀液以 0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加 10 倍系列稀释 选择 2 个～3 个连续的适宜稀释度的样品匀液，接种 Baird-Parker 平板 计数及血浆凝固酶试验 报 告 检 样 25 g(mL)样品+225 mL 稀释液，均质 45 h～48 h