实验十二 DNA的连接与转化 1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
实验十二 DNA的连接与转化 1.ＤＮＡ分子的体外连接 2．ＤＮＡ的转化及转化子的筛选
一．实验目的及背景 ▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。 ▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中
一．实验目的及背景 ▪ 当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。 ▪ 此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中
1、ＤＮＡ分子的体外连接 ▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的
1、ＤＮＡ分子的体外连接 ▪ ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段组 邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成磷酸 酸脂键的生物化学过程， ＤＮＡ分子的连接 是在酶切反应获得同种酶互补序列基础上进 行的
连接反应中值得注意的几个问题： ▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似
连接反应中值得注意的几个问题： ▪ 1.ＤＮＡ连接酶 ▪ 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 ▪ 二者的作用机理类似
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 ▪ Ｔ４连接酶作用分三步： ▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。 ▪ ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。 ▪ ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起 来
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制 ▪ Ｔ４连接酶作用分三步： ▪ １．Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形 成酶－ＡＭＰ复合物。 ▪ ２． 酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷 酸基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮ Ａ腺苷化。 ▪ ３．产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起 来