2.连接反应的温度 ▪ ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ▪ 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳 定，折衷方法是１２℃过夜
2.连接反应的温度 ▪ ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， ▪ 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳 定，折衷方法是１２℃过夜
3. DNA的平未端和粘性末端 ▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。 ▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的
3. DNA的平未端和粘性末端 ▪ 由于内切酶产生的DNA末端有平未端和粘性 末端，因而连接反应中就有平未端连接和粘 性末端连接。 二者连接效率不同。 ▪ 粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的
4.碱性磷酸酶处理质粒载体 ▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。见下图
4.碱性磷酸酶处理质粒载体 ▪ 为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的 浓度，增加重组子比例。这样就会出现ＤＮ Ａ自生连接问题， 为此通常选择对质粒载体 用碱性磷酸酶处理，除去其５’末端的磷酸 基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可 在转化细胞后得以修复。见下图