6 浙江大学 遗传学第十二章 31 农杆菌 感染产生 冠瘿瘤 ㈦、Ti质粒及其衍生载体： 适合于植物的载体系统¨将重组DNA运载到植物细胞中¨ 目的基因表达。 Ti质粒(细菌质粒)：自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌)细胞¨可诱导植物产生瘤细胞(tumorinducing, Ti) ¨冠瘿瘤(grown galltumors)。 Ti质粒有一部分转移DNA (transfer DNA，T-DNA)¨当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 (opine)，作为农杆菌碳源 和氮源。 浙江大学 遗传学第十二章 32 }Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。 浙江大学 遗传学第十二章 33 2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以 顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 浙江大学 遗传学第十二章 34 } Ti质粒是200~500kb环状DNA分子，主要有两套载体系统： ⑴. 双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E. coli和农杆菌中复 制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； ②. 非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。 将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中 的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵. 共整合载体(intergrated vectors)： 这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有 毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合 成一个载体。 浙江大学 遗传学第十二章 35 一般而言，一个基因 ¨ 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA 分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 四、基因的分离与鉴定： 浙江大学 遗传学第十二章 36 DNA的体外重组： 1.体外通过限制性内切酶 的修剪和DNA连接酶的 连接； 2.目标DNA分子 + 载体 DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子
6 浙江大学 遗传学第十二章 31 农杆菌 感染产生 冠瘿瘤 ㈦、Ti质粒及其衍生载体： 适合于植物的载体系统¨将重组DNA运载到植物细胞中¨ 目的基因表达。 Ti质粒(细菌质粒)：自然存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens，革兰氏阴菌)细胞¨可诱导植物产生瘤细胞(tumorinducing, Ti) ¨冠瘿瘤(grown galltumors)。 Ti质粒有一部分转移DNA (transfer DNA，T-DNA)¨当农杆菌感染植物时， T-DNA便转移到植物染色体上，诱导 冠瘿瘤，并能合成冠瘿碱 (opine)，作为农杆菌碳源 和氮源。 浙江大学 遗传学第十二章 32 }Ti质粒特点： 1. 具有五个主要功能区域： ①. T-DNA：LB与RB间T-DNA序列整合到植物基因组； ②. 质粒转移区(PT)； ③. 冠瘿碱(opine)代谢区； ④. 复制原点； ⑤. 毒性区。 浙江大学 遗传学第十二章 33 2. T-DNA中直接参与转移并整合的序列：T-DNA两端与 其它序列交界处的25bp不完全直接重复，右端的这段 序列称为右界(RB)，左端的序列称为左界(LB)。 3. V区的毒性基因：T-DNA转移所必需，毒性基因可以 顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 浙江大学 遗传学第十二章 34 } Ti质粒是200~500kb环状DNA分子，主要有两套载体系统： ⑴. 双元载体(binary vectors) ：该系统具有两个质粒： ①. 用于克隆外源基因片段的克隆质粒：在E. coli和农杆菌中复 制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒； ②. 非致病质粒：具有毒性基因，没有T-DNA序列。 将两个质粒分别导入进农杆菌中，经农杆菌介导，克隆质粒中 的外源DNA转移到植物染色体中。 ⑵. 共整合载体(intergrated vectors)： 这个系统包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有 毒性基因，但这两个质粒具有一段同源序列，在农杆菌中重组整合 成一个载体。 浙江大学 遗传学第十二章 35 一般而言，一个基因 ¨ 是编码一条多肽链的一个DNA 片段，包括启动子、终止子及内含子等。 在DNA重组技术出现之前，由于DNA 分子量大而结构单一，DNA是细胞中最难 分析的大分子。 DNA重组技术发展成功之后，DNA已 成为细胞中最易操作分析的大分子。 四、基因的分离与鉴定： 四、基因的分离与鉴定： 浙江大学 遗传学第十二章 36 DNA的体外重组： 1.体外通过限制性内切酶 的修剪和DNA连接酶的 连接； 2.目标DNA分子 + 载体 DNA，共价连接； 3.获得重组DNA分子
7 ㈠、从基因库中分离基因： 1. 基因库（library）： 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体。从基因库 中分离基因，首先要构建 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 散弹枪法构建基因文库 浙江大学 遗传学第十二章 38 ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞¨收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进 噬菌体¨感染细菌¨收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体： 重组人工染色体¨导入宿主细胞¨收集细胞。 浙江大学 遗传学第十二章 39 ②. 染色体基因库： 将染色体用来构建基因库¨可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体：对染色体 进行微切割，可以 构建染色体区段的 基因文库。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离 (flow cytometry)技术将人类染色体分开¨构建单个染色体基因库 ¨加速人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离染色体进行 涂色验证 浙江大学 遗传学第十二章 41 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electrophoresis, PFGE) ，将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后，用于构建染色体库，在基因组的分析中 发挥作用。 浙江大学 遗传学第十二章 42 ③. cDNA库： 以mRNA为模板Î反转录酶 合成互补DNA Î构建基因库。 真核生物mRNA3’端有一段 多聚A尾端 Î 双链DNA分子经 两端补齐 Î以带限制性酶切点 的人工接头连接Î酶切后与载 体(通常是噬菌体)连接 Î 制备 cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织 内表达基因的mRNA序列Î仅包 括基因组的部分基因序列。 开始合成cDNA cDNA-RNA杂合双链 cDNA3’发夹结构 合成第二链 双链cDNA play-T引物
7 ㈠、从基因库中分离基因： 1. 基因库（library）： 是一组DNA和cDNA序 列克隆的集合体。从基因库 中分离基因，首先要构建 基因库。 根据克隆核酸序列、来 源，基因库可分为： 核基因库、染色体库、 cDNA库、线粒体库等。 散弹枪法构建基因文库 浙江大学 遗传学第十二章 38 ①. 核基因库 ： 核基因库(genomic library)：将某生物全部基因组DNA 酶切后与载体连接构建而成。 构建文库可采用不同的载体： 质粒载体：重组质粒导入感受态细胞¨收集菌落。 噬菌体或柯斯质粒 (cosmid)载体：将重组DNA包装进 噬菌体¨感染细菌¨收集噬菌斑。 BAC(细菌人工染色体)或YAC(酵母人工染色体)载体： 重组人工染色体¨导入宿主细胞¨收集细胞。 浙江大学 遗传学第十二章 39 ②. 染色体基因库： 将染色体用来构建基因库¨可选择特异基因和分析 染色体结构和组织。 如果蝇的多线 染色体：对染色体 进行微切割，可以 构建染色体区段的 基因文库。 人类基因组项目研究中，利用流动细胞分离 (flow cytometry)技术将人类染色体分开¨构建单个染色体基因库 ¨加速人类基因组作图和分析。 流式细胞分离原理 分离染色体进行 涂色验证 浙江大学 遗传学第十二章 41 酵母菌： 利用改良的脉冲电泳方法(pulsed field gel electrophoresis, PFGE) ，将酵母菌16根染色体依据其分子量 大小分开后，用于构建染色体库，在基因组的分析中 发挥作用。 浙江大学 遗传学第十二章 42 ③. cDNA库： 以mRNA为模板Î反转录酶 合成互补DNA Î构建基因库。 真核生物mRNA3’端有一段 多聚A尾端 Î 双链DNA分子经 两端补齐 Î以带限制性酶切点 的人工接头连接Î酶切后与载 体(通常是噬菌体)连接 Î 制备 cDNA库。 cDNA库与核DNA库不同： cDNA库仅具有细胞或组织 内表达基因的mRNA序列Î仅包 括基因组的部分基因序列。 开始合成cDNA cDNA-RNA杂合双链 cDNA3’发夹结构 合成第二链 双链cDNA play-T引物
8 浙江大学 遗传学第十二章 43 2. 筛选基因库： 根据待选基因相关信息 Î 确定筛选方法和条件 Î从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或 寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或 非放射性同位素标记探针 Î 筛选基因库。 浙江大学 遗传学第十二章 44 筛库过程： 将噬菌体感染形成的噬菌 斑印影在硝酸纤维膜上变性 Î 带有目的基因的放射性DNA或 cDNA作探针进行杂交Î放射性 自显影 Î 杂交信号（黑点）对 应的噬菌斑即为阳性克隆。 浙江大学 遗传学第十二章 45 3. 阳性克隆的分析与鉴定： 从基因库中筛选出阳性克隆 Î 分析、鉴定 Î 得到 目的基因。 ⑴. 限制性酶图谱： 构建阳性克隆的限制性酶图谱 Î 根据同源性分析， 了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置 Î 用于进一步 亚克隆或同已知的其它序列比较。 浙江大学 遗传学第十二章 46 CK Not I Sal I Not I + Sal I 图：一个 15kb DNA片段 的限制性酶图谱构建方法。 不同DNA用限制性酶酶切， 根据其产生的多型性，即限制 性酶片段长度的多型性 Î 来 分析DNA水平的变异程度， 以RFLP作为分子标记进行基因 组图谱分析。 9 浙江大学 遗传学第十二章 47 ⑵. 核酸分子杂交： ①. Southern杂交分析：由英国 Southern (1975)发明，将琼脂糖中 的DNA转移到尼龙膜Î进行DNA 分子杂交分析的方法。 筛选基因库得到阳性克隆Î将 限制性酶酶切与Southern杂交结合 Î绘制限制性酶图谱。 浙江大学 遗传学第十二章 48 ②. Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和程序相同。 用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平， 检测mRNA的存在
8 浙江大学 遗传学第十二章 43 2. 筛选基因库： 根据待选基因相关信息 Î 确定筛选方法和条件 Î从基因库中筛选、分离基因。 多数方法是利用一段核苷酸序列(DNA、cDNA或 寡聚核苷酸)或抗体作探针(Probe)，用放射性同位素或 非放射性同位素标记探针 Î 筛选基因库。 浙江大学 遗传学第十二章 44 筛库过程： 将噬菌体感染形成的噬菌 斑印影在硝酸纤维膜上变性 Î 带有目的基因的放射性DNA或 cDNA作探针进行杂交Î放射性 自显影 Î 杂交信号（黑点）对 应的噬菌斑即为阳性克隆。 浙江大学 遗传学第十二章 45 3. 阳性克隆的分析与鉴定： 从基因库中筛选出阳性克隆 Î 分析、鉴定 Î 得到 目的基因。 ⑴. 限制性酶图谱： 构建阳性克隆的限制性酶图谱 Î 根据同源性分析， 了解阳性克隆片段的酶切位点及相对位置 Î 用于进一步 亚克隆或同已知的其它序列比较。 浙江大学 遗传学第十二章 46 CK Not I Sal I Not I + Sal I 图：一个 15kb DNA片段 的限制性酶图谱构建方法。 不同DNA用限制性酶酶切， 根据其产生的多型性，即限制 性酶片段长度的多型性 Î 来 分析DNA水平的变异程度， 以RFLP作为分子标记进行基因 组图谱分析。 9 浙江大学 遗传学第十二章 47 ⑵. 核酸分子杂交： ①. Southern杂交分析：由英国 Southern (1975)发明，将琼脂糖中 的DNA转移到尼龙膜Î进行DNA 分子杂交分析的方法。 筛选基因库得到阳性克隆Î将 限制性酶酶切与Southern杂交结合 Î绘制限制性酶图谱。 浙江大学 遗传学第十二章 48 ②. Northern杂交分析： 与Sorthern杂交的原理和程序相同。 用于分析克隆的基因在某一细胞或组织的转录水平， 检测mRNA的存在